抗牙齦卟啉單胞菌卵黃抗體脂質體的制備及抗菌作用研究

韓 旭，徐 燕，徐涵穎，王騰飛，沈繼龍，桂雙英

牙齦卟啉單胞菌(

Porphyromonas

gingivalis

，

P.gingivalis

) 是慢性牙周炎的主要致病菌，與牙周炎的發生發展密切相關，目前臨床常用輔助治療藥物如洗必泰、西吡氯銨等不僅作用時間短，而且長期使用易誘發耐藥菌株和毒副作用，因此尋找一種安全有效的治療方式具有重要的臨床意義。該研究通過接種

Pg

通過主動免疫產蛋母雞的方法獲得針對牙周致病菌的卵黃抗體。采用薄膜超聲分散法制備抗Pg-IgY脂質體，通過物理、形態超微結構、包封率、藥物釋放曲線和體外抗菌活性分析評價藥物，以期達到藥物緩釋性能，提高藥效的作用。

1 材料與方法

1.1 材料與設備

P.gingivalis

(JCM12257) (國際標準菌株 ATCC33277，廣東省微生物菌種保藏中心)；哥倫比亞血瓊脂培養基(江門凱林貿易有限公司)；BCA 檢測試劑盒(北京原平皓生物)；抗Pg-IgY溶液(合肥安科生物有限公司)；卵磷脂(德國利保德公司)；膽固醇、三氯甲烷、生育酚等試劑(天津博迪化工技術有限公司)；細菌基因組DNA提取試劑盒(北京天根)；厭氧培養箱(Don Whitley DG250 Anaerobic workstation，英國)；恒溫磁力攪拌儀(常州智博瑞儀器有限公司)；N-1001型旋轉蒸發儀(日本EYELA公司)；透射電鏡(JEM-ARM300F2，日本電子)；紫外可見分光光度計光譜分析儀(上海美普達公司)。

1.2

培養與鑒定

將

P.gingivalis

(ATCC33277)凍干粉，接種于哥倫比亞血瓊脂培養基中，置于厭氧培養箱中(混合氣比例：80% N、10% CO、10% H)，37 ℃培養48 h，見黑色菌落長出，挑取單個菌落接種于BHI液體培養基(加入維生素K1及氯化血紅素)進行擴菌培養，培養24 h后用DNA提取試劑盒提取細菌的DNA利用

P.gingivalis

的16s rRNA引物進行鑒定。由上海生物工程有限公司合成鑒定。

1.3 實驗樣品制備

1

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3

.

1

BCA法測定蛋白濃度 取20 μl蛋白標準品(25 mg/ml BSA溶液)，加入980 μl蛋白稀釋液，配置成0.5 g/L，分別在96孔板中加入0、1、2、4、8、12、16、20 μl上述溶液，分別加入標準品稀釋至20 μl。向每個孔中加入200 μl BCA工作溶液，37 ℃恒溫箱中反應30 min，測量562 nm處吸光度(optical density, OD)值(A)。以濃度C(g/L)對OD值進行線性回歸。求出標準曲線Y=1.984X-1.137，

R

=0.976。

1

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3

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2

抗Pg

-

IgY脂質體的制備方法 采用薄膜分散超聲法制備抗Pg-IgY脂質體， 稱取120 mg卵磷脂和15 mg膽固醇并加入0.1 mg親脂性抗氧化劑，置于圓底燒瓶內加入10 ml有機溶劑氯仿。超聲震蕩使其充分溶解，置于旋轉蒸發儀上旋轉蒸發除去有機溶劑(400～700 kPa、30 ℃、60 min)，在燒瓶壁內形成一層均勻薄膜。用10 ml抗Pg-IgY溶液將脂質膜水合，得到抗 Pg-IgY脂質體混懸液，將細胞破碎儀的超聲探頭在冰浴的條件下超聲破碎6 min(超聲破碎4 s，暫停6 s，功率250 W)，探頭浸入樣品中且稍高于燒瓶1 cm,超聲完成后乳白色的混懸液變為乳光狀均勻懸液，對光透過樣品可看清物品，即為抗 Pg-IgY脂質體。

1

.

3

.

3

測定抗Pg

-

IgY脂質體的粒徑和Zeta電位 抗 Pg-IgY脂質體加適量超純水稀釋, 取4個樣品使用納米粒子粒徑分析儀測定平均粒徑、多分散指數(PDI)和Zeta電位，透射電子顯微鏡下觀察其外觀形態。

1

.

3

.

4

精密度實驗 取低、中、高濃度3個濃度的抗 Pg-IgY脂質體溶液，進行連續 6次HPLC 進樣測定峰面積，精密度的RSD為 0.85%，小于 2%，認為儀器的精密度良好。穩定性的RSD 為 0.60%，小于2%，表明樣品的穩定性良好。

1

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3

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5

脂質體包封率測定將抗 Pg-IgY脂質體溶于pH 7.4的緩沖液中并定容至5 ml,量取1 ml置于20 KD 超速離心管中，4 ℃下，20 000 r/min離心 1 h，分離出脂質體和游離藥物，緩沖液洗滌超速離心管3次，取上層離心的上清液作為游離藥物量,記為C游(μg/ml)和以未離心前的樣品計算總藥物量記為C總(μg/ml),根據公式計算其包封率. 包封率(EE%)=( C總-C游)/C總×100%

1

.

3

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6

體外釋放實驗取制備所得抗Pg-IgY脂質體溶液，量取3 ml抗Pg-IgY脂質體溶液轉移到透析袋中。透析介質為pH7.4的PBS緩沖液，透析袋截留分子量為8 000～15 000 kD，將透析袋的末端固定并放于含有200 ml PBS緩沖液的燒杯中。37 ℃恒溫水浴條件下進行磁力攪拌，于0.5、1、2、8、12、24、36、48、72、96、120、144 h分別從燒杯中取1 ml樣品并同時補充等體積透析介質，用BCA法測出每個取樣時間點透析介質中的蛋白含量，以0 h時透析袋內的蛋白含量作為總含量，二者之比即為累積釋放率。

1.4 抑菌實驗

1

.

4

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1

最小抑菌濃度(minimum inhibitory concentration,MIC)和最小殺菌濃度(minimum bactericidal concentration,MBC)的測定配制成終濃度為16.00、8.00、4.00、2.00、1.00、0.50和0.25 mg/ml 7個不同濃度藥液。取一塊96孔板，共9個濃度組，其中1-7組為實驗組，第8組陽性對照組只加200 μl菌液，第9組陰性對照組加等體積的BHI培養基和抗Pg-IgY脂質體。每組設4個復孔測量每組的OD值(A)將震蕩混勻后的96孔板培養48 h，再次測量共培養后的OD值(A)。肉眼觀察到無渾濁出現的為最小抑菌濃度值,選擇大于MIC的各孔，分別取20 μl劃線接種于固體血瓊脂培養基，37 ℃厭氧條件下培養48 h，觀察菌落數少于5～6個的最低濃度為殺菌濃度。

1

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4

.

2

抑菌動力學測試 參考1.4.1的實驗結果，繪制抗Pg-IgY脂質體對

P.gingivalis

的kill-time曲線。將抗 Pg-IgY脂質體溶液配置為不同濃度。在1 ml不同濃度的抗 Pg-IgY脂質體溶液中加入200 μl濃度1×10CFU/ml的菌液，厭氧培養箱內培養48 h。每小時取樣100 μl，每管取2個樣本，連續取樣12 h后，檢測所有樣本的OD值(A)，取平均值繪制細菌生長曲線。

2 結果

2.1 抗 Pg-IgY脂質體的粒徑和Zeta電位

測得平均粒徑為(175.43±3.25)nm、PDI為0.263脂質體分布較為均勻，PDI值在0.1～0.3之間，表明體系具有均勻的分散性。Zeta電位為(-37.82±0.20)mV。粒徑均勻穩定如圖1所示。當Zeta電位的絕對值大于30 mV時，納米體系是穩定的。

2.2 抗 Pg-IgY脂質體形態觀察

使用透射電鏡觀察抗Pg-IgY脂質體，樣品粒徑分布較均一，形狀大多數是卵圓形，可觀察到明顯的磷脂雙分子層狀結構，脂質體的表面光滑，藥物囊泡完整，如圖2A。圖2B中紅色箭頭標識為正在釋放的藥物，黃色箭頭標識為釋放后的磷脂碎片，此時脂質體已變形。圖2C為未包封在脂質體中的游離的抗Pg-IgY。圖3在牙周炎局部微環境中藥物釋放的示意圖。

圖1 抗Pg-Igy脂質體粒徑分布圖

2.3 抗 Pg-IgY脂質體包封率測定

包封率的測定是檢測脂質體內包裹的藥物含量和游離藥物含量，抗 Pg-IgY為水溶性藥物，脂質體與抗 Pg-IgY粒徑大小有差別，無重疊，所以采用超速離心法測定包封率。見表1。

圖2 抗 Pg-IgY脂質體透射電鏡圖

圖3 抗Pg-IgY脂質體實體圖及在牙周炎局部微環境中藥物釋放的示意圖

表1 抗Pg-IgY脂質體包封率(n=4)

2.4 抗 Pg-IgY脂質體的體外釋放曲線

抗Pg-IgY脂質體具有明顯的藥物緩釋性能。藥物在0.5 h時累積釋放率為2.75%，0～4 h這段時間內PBS溶液中的蛋白質濃度顯著增加，在4 h內藥物累積釋放率僅為20.8%，釋放率少于30%，表明該藥物不會發生突然釋放。在4～72 h PBS溶液中的蛋白濃度明顯升高，表明這一階段藥物釋放增加，藥物累積釋放量達到80%左右，72～144 h這一階段藥物釋放逐漸緩慢，144 h的累積釋放率為83.4%.從釋放曲線趨勢來看，藥物仍在緩慢釋放，說明該藥物有緩釋效果。見圖4。

圖4 抗Pg-IgY脂質體體外釋放率曲線

2.5 抗Pg-IgY脂質體對

的MIC和MBC

抗Pg-IgY脂質體對

P.gingivalis

的MIC值為4 mg/ml，在抗 Pg-IgY脂質體達到細菌的MIC值時，產生明顯的抑菌作用可以抑制病原微生物的生長，MBC值為8 mg/ml，當濃度要達到或超過MBC，才能殺滅病原微生物。當抗 Pg-IgY脂質體濃度越小，其病原微生物的活性越強。

2.6 抑菌動力學測試

在16、8 mg/ml 2個濃度組培養前后的OD值沒有下降，差異沒有統計學意義，表明在該濃度下，細菌是不能生長的。而在4 mg/ml 的濃度及以下培養前后測定的OD值有明顯增加，差異有統計學意義。見表2。

表2 抗Pg-Igy脂質體各濃度組培養前后OD值

2.7 抗Pg-IgY脂質體對

的時間-殺菌曲線

抗Pg-IgY脂質體對

P.gingivalis

在藥物濃度為4 mg/ml在10 h后產生明顯的抑菌效果，可以抑制

P.gingivalis

生長，在達到8 mg/ml的濃度時9 h后可以達到殺菌效果。見圖5。

3 討論

牙周病是由牙菌斑生物膜引起的一種破壞牙周支持組織的細菌感染性疾病，在已發現的700多種口腔微生物中，絕大多數細菌在口腔中是正常菌群，僅極少數的細菌(約30種)與各型牙周病的發生和發展密切相關。不同類型的牙周病存在一種或幾種主要的致病菌。 牙周病常見主要致病菌包括：

P.g

，伴放線聚集桿菌(

Actinobacillusa

ctinomycetemcomitans

，

A.a

)，具核梭桿菌(

Fusobacterium

nucleatum

，

F.n

)，中間普氏菌(

Prenella

intermediate

，

P.i

)等。 當前牙周病去除牙菌斑生物膜的方法主要包括：機械治療、牙周手術治療和藥物治療等。機械治療僅去除大部分的牙菌斑、牙石和感染的牙骨質，但不能徹底清除操作器械不易到達的牙周袋深處感染部位的細菌感染組織，炎癥無法消退，附著水平和牙槽骨吸收沒有減少，病情加重。還需藥物治療作為補充用以控制感染和炎癥，防止細菌再次黏附定植于牙周袋內。

圖5 抗Pg-Igy脂質體對牙齦卟啉單胞菌Kill-time曲線

抗Pg-IgY脂質體能殺滅牙周病原菌，既能彌補機械治療的不足，又能有效避免抗生素的過度使用和其他藥物之間的拮抗作用。本實驗采用薄膜超聲分散法制備抗Pg-IgY脂質體。制備出的脂質體多數為大多室脂質體，由于使用超聲探頭進行脂質體破碎，雖然在冰浴條件下，仍會造成一部分脂質體被破壞使得包封率進一步下降。

本實驗體外藥物釋放在0～4 h內是未包封在脂質體中的游離藥物釋放，釋放率少于30%，表明該藥物不會發生突然釋放。8～96 h為包裹在脂質體內抗Pg-IgY緩慢釋放，從曲線可看出144 h仍有釋放趨勢，表明抗Pg-IgY脂質體具有緩釋作用，提高目標部位的有效藥物濃度，為卵黃抗體在牙周病的被動免疫治療中的使用和推廣提供了新的思路。 為進一步研究治療慢性牙周炎的藥物新劑型奠定了理論基礎。