摻鍶TiO2納米管涂層種植體的促成骨性能研究

朱 曄，溫黎明，李 任，畢文娟，于津建，鄭天霞，戚孟春

鈦(Ti)及其合金由于其優(yōu)良的機(jī)械性能和生物相容性，被廣泛用作生物醫(yī)學(xué)材料。然而，Ti基金屬生物活性較差，鈦表面的骨生長機(jī)制主要取決于表面微結(jié)構(gòu)的骨傳導(dǎo)，而不是骨誘導(dǎo)。為了賦予Ti種植體良好的生物活性，目前多種Ti金屬表面改性技術(shù)已經(jīng)被應(yīng)用于誘導(dǎo)骨生成。其中，陽極氧化是制備具有納米管狀TiO涂層的一種技術(shù)，其結(jié)構(gòu)有利于細(xì)胞的黏附和增殖，從而提高種植體的骨整合性能；還可以容納生物活性藥物，一些金屬元素被負(fù)載其中，可賦予種植體更佳的骨生成誘導(dǎo)能力，其中，鍶(Sr)是對促進(jìn)骨生成具有較大價(jià)值的元素之一。該實(shí)驗(yàn)擬將Sr摻入TiO納米管中，驗(yàn)證該涂層的促成骨性能。

1 材料與方法

1.1 材料

TA2 鈦片、鈦種植體購于廣州泰沃克公司； Sr(OH)、CCK-8 試劑盒購于上海麥克林公司； MC3T3-E1細(xì)胞購于上海生命科學(xué)院細(xì)胞庫；BCA 蛋白定量檢測試劑盒購于上海碧云天生物科技公司；ALP 檢測試劑盒購于南京建成生物工程研究所；SD大鼠由華北理工大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心提供。

1.2 器械

電子掃描顯微鏡(Scanning Electron Microscope，SEM)(JSM-IT100，日本JEOL)、X射線衍射儀(D/MAX-rB，日本理學(xué)公司)、原子力顯微鏡(Atomic Force Microscope, AFM)(Flex-Axiom，瑞士Nanosurf公司)表面接觸角測量儀(DH-HV，北京哈科試驗(yàn)儀器廠)、電感耦合等離子體光譜儀(ICAP7000 Plus，美國賽默飛)均由華北理工大學(xué)實(shí)驗(yàn)檢測中心提供。

1.3 方法

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體外實(shí)驗(yàn)試件制備 實(shí)驗(yàn)所用的試件均為 TA2 圓形鈦片，厚度0.3 mm，直徑33 mm，分為以下3組：Ti組，純鈦片經(jīng)過物理、化學(xué)拋光后備用；TiO組，純鈦片經(jīng)過物理、化學(xué)拋光后進(jìn)行陽極氧化處理，電解液配比如下：0.5%質(zhì)量百分比氟化銨、3%的HO 及 97%體積百分比的乙二醇，構(gòu)建TiO納米管涂層；TiO+Sr組，TiO納米管涂層經(jīng)過加入Sr(OH)溶液的水熱反應(yīng)處理，具體方法為：在馬弗爐內(nèi)膽中配制 6.2 g/L 濃度的Sr(OH)溶液后，將TiO納米管試件浸泡于其中，置于 400 ℃下 3 h。

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體內(nèi)實(shí)驗(yàn)分組 選取 TA2 純鈦種植體，種植體全長 8.5 mm，種植體螺紋間距 0.5 mm，螺紋高度0.5 mm。根據(jù)植入種植體類型不同，將體內(nèi)實(shí)驗(yàn)分為以下3組：Ti、TiO、TiO+Sr組，制作方法與上述1.3.1相同。

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試件表面特征檢測 試件表面微觀形貌用SEM進(jìn)行觀察，對試件的表面微觀形貌進(jìn)行觀察；采用SEM相配合的能譜分析對涂層表面元素組成進(jìn)行分析；采用X射線衍射儀對構(gòu)建的涂層進(jìn)行晶相分析；采用原子力顯微鏡對表面涂層的粗糙度(roughness，Ra)進(jìn)行測量。采用表面接觸角測量儀，測量去離子水在不同涂層上的接觸角，檢測涂層親水性；采用電感耦合等離子體光譜儀測量摻 Sr 涂層的Sr離子的釋放濃度。

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試件表面促進(jìn)細(xì)胞黏附、增殖及成骨性能的體外實(shí)驗(yàn) 使用熒光顯微鏡觀察細(xì)胞初期黏附：將鈦片置于6孔板，吸取細(xì)胞懸液以 1×10個(gè)/ml 接種于鈦片上，培養(yǎng)2 h后使用4%多聚甲醛溶液進(jìn)行細(xì)胞固定1 h，再加入0.5%的 Triton-X，靜置 20 min，再加入鬼筆環(huán)肽和DAPI 染色劑，使用熒光顯微鏡進(jìn)行觀察并對黏附細(xì)胞數(shù)目進(jìn)行定量評價(jià)；使用CCK-8法檢測細(xì)胞增殖活性：細(xì)胞接種方法如上，于第1、4、7和11天使用CCK-8試劑盒檢測450 nm波長下吸光度(optical density, OD)值；檢測細(xì)胞堿性磷酸酶活性(alkaline phosphatase activity assay，ALP)，細(xì)胞接種方法如上，更換培養(yǎng)基為含2%胎牛血清和成骨誘導(dǎo)液的完全培養(yǎng)基，于4和7 d檢測各組ALP活性，各組試件細(xì)胞的ALP活性采用ALP測定試劑盒檢測，檢測520 nm波長下的OD值。

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試件表面促進(jìn)細(xì)胞增殖及成骨性能的體內(nèi)實(shí)驗(yàn) 選取9只麻醉后體質(zhì)量為 200 g左右的1月齡雌性SD大鼠[華阜康SCXK(京)2014-004]，經(jīng)華北理工大學(xué)動物倫理委員會批準(zhǔn)(LX2019060)，將大鼠隨機(jī)分組,于大鼠左側(cè)股骨干骺端使用牙科種植機(jī)鉆頭進(jìn)行備洞，植入不同組種植體。在種植體植入后 1月和 3月，脫頸方法處死大鼠取材，將帶種植體的股骨使用Micro-CT掃描。在重建的三維圖像上分析感興趣區(qū)域(range of interests，ROI)，即骨髓腔內(nèi)種植體螺峰外周圍 1 mm 的圓柱形(直徑 4 mm)區(qū)域。檢測指標(biāo)為骨體積分?jǐn)?shù)即礦化骨體積(bone volume，BV)占骨組織總體積(tissue volume, TV)的百分比[(BV/TV)×100%]。

2 結(jié)果

2.1 試件涂層表面形貌觀察

試件涂層表面形貌觀察見圖1。Ti組表面平坦，可見不規(guī)則劃痕和凹坑；TiO組可見“蜂窩狀”排布的納米管，管口呈圓形或橢圓形；TiO+Sr組可見經(jīng)過水熱反應(yīng)以后，TiO納米管變得不規(guī)則，且管壁增厚，管徑變小。

圖1 各組涂層表面微觀形貌SEM和AFM觀察A： Ti組；B： TiO2組; C： TiO2+Sr組

圖2 各組涂層表面元素分布(EDS)和X射線衍射儀分析(XRD)A： Ti組；B： TiO2組; C： TiO2+Sr組

2.2 試件涂層表面元素分布和晶相分析

試件涂層表面元素分布觀察見圖2、表1。TiO+Sr組可檢測到Sr元素存在；XRD分析顯示，經(jīng)過陽極氧化，TiO組相對于Ti組的銳鈦礦型增加，基底礦型減少，說明Ti組由基底礦型向銳鈦礦型轉(zhuǎn)變，并出現(xiàn)了金紅石相礦峰，TiO+Sr組除了上述礦峰以外，還有鈦酸鍶的礦峰。

表1 各組試件表面EDS元素含量分析

2.3 試件涂層表面粗糙度和親水性分析

試件涂層表面粗糙度和親水性分析見表2。通過AFM檢測Ra顯示，與Ti組相比，TiO組Ra升高；TiO組和TiO+Sr組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；測量涂層表面親水性顯示，與Ti組相比，TiO組水接觸角變小，TiO+Sr組最小。

表2 涂層表面粗糙度和親水性分析

2.4 Sr

釋放檢測

單位時(shí)間內(nèi)Sr釋放濃度見圖3。在1～3 d內(nèi)Sr大量釋放，直至3d后釋放趨于穩(wěn)定，30 d后釋放濃度幾乎可忽略不計(jì)。

圖3 Sr2+釋放濃度分析

2.5 試件表面MC3T3-E1細(xì)胞黏附、增殖活性檢測

由圖4、表3可見，2 h時(shí)通過熒光顯微鏡觀察細(xì)胞黏附情況顯示，TiO+Sr組細(xì)胞數(shù)量(17.66±1.52)最高，Ti組細(xì)胞數(shù)量(10.00±2.64)最低。于1、4、7和11 d時(shí)，對涂層表面細(xì)胞增殖使用CCK-8法檢測OD值，TiO+Sr組OD值在各時(shí)間點(diǎn)均最高，Ti組最低，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

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<0.05)。

圖4 各組試件表面細(xì)胞初期黏附的熒光顯微鏡觀察

表3 4 涂層表面細(xì)胞增殖CCK-8法檢測吸光度值

2.6 試件表面MC3T3-E1細(xì)胞ALP活性檢測

MC3T3-E1細(xì)胞的ALP活性檢測由表4所示。 4、7 d時(shí)， TiO+Sr組ALP活性最高，Ti組最低，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

P

<0.05)。

表4 各試件表面MC3T3-E1細(xì)胞的ALP活性檢測分析

2.7 Micro-CT檢測

種植體植入1月和3月的SD大鼠股骨Micro-CT檢測由圖5、表5所示。3D重建和橫截面影像圖顯示，1月和3月時(shí)TiO+Sr組周圍骨小梁密度最高，Ti組最低，種植體周圍ROI區(qū)域BV/TV比值分析顯示，TiO+Sr組周圍骨體積量最大。

表5 種植體植入1月和3月的SD大鼠股骨Micro-CT檢測分析

3 討論

目前，為構(gòu)建具有優(yōu)良生物相容性的新型骨修復(fù)種植體，實(shí)現(xiàn)提高種植體的骨結(jié)合目的。越來越多的研究者開始從納米尺度對Ti種植體表面進(jìn)行改性處理，以期為細(xì)胞提供一個(gè)穩(wěn)定可控的微環(huán)境。

TiO納米管結(jié)構(gòu)對細(xì)胞行為具有顯著影響， TiO納米管能夠促進(jìn)MC3T3-E1細(xì)胞肌動蛋白骨架的組裝，利于其黏附，同時(shí)可以提高骨功能相關(guān)基因的早期表達(dá)水平。與此同時(shí)，它可以充當(dāng)一個(gè)很好的藥物的載體。大量研究證實(shí)負(fù)載生物活性成分的TiO納米管結(jié)構(gòu)，表現(xiàn)出比單純 TiO納米管更好的促進(jìn)細(xì)胞成骨分化性能。與此同時(shí)，生物相容性元素(Ag、Sr等)在骨組織修復(fù)和再生中起著重要作用。其中，Sr在成骨分化上具有優(yōu)異的表現(xiàn)，Andersen et al利用磁控濺射技術(shù)沉積SrTiO涂層，Sr不斷地從涂層中釋放，促進(jìn)了新骨生成。

圖5 各組種植體Micro-CT檢測 A：3D重建縱切面截面圖；B：種植體橫截面影像圖

本實(shí)驗(yàn)對涂層理化性能檢測顯示，通過將TiO納米管涂層浸入Sr(OH)溶液中經(jīng)過水熱反應(yīng)，成功構(gòu)建了摻Sr-TiO納米管涂層，相較于純Ti表面，摻Sr-TiO涂層的粗糙度和親水性顯著增加。對Sr釋放濃度檢測表明，涂層中的SrTiO涂層釋放的Sr在細(xì)胞黏附和增殖期均存在有效劑量的釋放，細(xì)胞增殖熒光顯微鏡觀察和CCK-8檢測細(xì)胞增殖結(jié)果顯示Sr的釋放有利于細(xì)胞的初期黏附和增殖，而細(xì)胞增殖狀態(tài)好壞是影響骨生成的重要條件。

ALP活性的高低可反映出成骨定向分化能力和細(xì)胞促礦化能力。ALP檢測結(jié)果說明涂層中Sr的釋放可有效提高M(jìn)C3T3-E1細(xì)胞ALP活性。為了分析TiO+Sr組對細(xì)胞成骨能力的影響，在各組種植體植入大鼠股骨1、3月后，對帶有種植體的股骨進(jìn)行了Micro-CT掃描。ROI區(qū)域分析結(jié)果顯示，植入1、3月后，TiO+Sr組種植體周圍骨量均要顯著地高于其他2組，說明種植體中Sr的釋放有利于骨生成。

綜上所述，課題組利用AO在純鈦片表面構(gòu)建了TiO納米管，并通過水熱反應(yīng)成功地將Sr摻入，對涂層的理化性能進(jìn)行了表征檢測分析；體外細(xì)胞學(xué)研究表明，摻Sr-TiO納米管涂層顯著地提高了 MC3T3-E1細(xì)胞的增殖和成骨分化能力；體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證實(shí)，摻Sr-TiO納米管種植體顯著促進(jìn)了種植體與周圍骨組織的骨結(jié)合能力。