鐵酸鋅磁性納米顆粒誘導活性氧及促死亡自噬殺傷腎癌細胞的實驗研究

楊荷宇，張 力,3,4，聞慧琴，溫誠浩，王 輝，梁朝朝,3

腎細胞癌是源自腎實質泌尿小管上皮系統的惡性腫瘤。據統計，2020年美國預計新發腎癌病例數73 750例，預計死亡病例數14 830例。早期腎癌患者可行手術治療，而部分患者在初次就診時已發生遠處轉移，并且轉移性腎癌患者對化療或免疫治療不敏感。因此，對早期腎癌進行靈敏特異的診斷以及擺脫轉移性腎癌的治療困境，具有重要的臨床意義。

納米材料是指至少在三維空間中的一維處于納米尺度(1～100 nm)范疇內的材料，其中，鐵酸鋅納米顆粒(zinc ferrite nanoparticles, ZF NPs)因其優良的特性而備受關注。較于傳統MRI造影劑，ZF NPs不僅能更加清晰地顯示狹窄的血管，還在抗腫瘤等方面具有廣闊的應用前景。在腎癌診斷中，MRI可區分良性實體腫塊與腎細胞癌亞型，明確腫瘤的組織學分級，并可避免不必要的手術。該文主要研究ZF NPs的抗腫瘤效應，并進一步探討活性氧(reactive oxygen species，ROS)及自噬在ZF NPs殺傷腎透明細胞癌Caki-1中的關聯與調控機制，旨在為臨床診療腎癌提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

六水合三氯化鐵(FeCl·6HO)(美國Sigma Aldrich公司)；氯化鋅(ZnCl)、聚乙二醇、氨水(北京國藥集團)；MTT、二甲基亞砜及海藻糖(德國Bio Froxx公司)；ROS檢測試劑盒(上海碧云天生物技術研究所)；抗LC3B抗體(美國Proteintech公司)；渥曼青霉素(美國MCE公司)；熒光顯微鏡(日本Olympus公司)；流式細胞儀(美國Beckman公司)。

1.2 材料合成

稱取1.514 g的FeCl·6HO與0.382 g的ZnCl溶于25 ml去離子水中，磁子攪拌至溶液澄清，加入5 g聚乙二醇，繼續攪拌形成溶液A。配置0.7%的氨水溶液，在磁子攪拌下，迅速向溶液A中加入25 ml的氨水溶液，混合溶液在超聲破碎機下超聲30 min后，100 ℃下加熱30 min。冷卻至室溫，溶液繼續在超聲破碎機下超聲30 min后，去離子水稀釋溶液，0.22 μm濾膜除菌。

1.3 細胞株及細胞培養

人腎癌Caki-1細胞株購自中國科學院細胞庫(北京)；在37 ℃、5% CO培養箱中培養，DMEM培養液中添加10%胎牛血清及青、鏈霉素各100 U/ml。胰蛋白酶定期消化細胞進行傳代培養，取對數生長期細胞用于實驗。

1.4 細胞活力檢測

Caki-1細胞以4×10個/ml接種于96孔板，貼壁后每孔分別加入不同濃度或種類的藥物定容至100 μl，并設置細胞活力對照組。培養24 h后，每孔加入20 μl MTT溶液(5 mg/ml)培養4 h，吸棄上清液，每孔加入150 μl二甲基亞砜，使用酶標儀以490 nm波長測定各孔吸光度。

1.5 細胞內ROS測定

Caki-1細胞以1.2×10個/ml接種于12孔板，貼壁后每孔分別加入不同濃度或種類的藥物定容至1 ml，并設置ROS對照組。培養6 h后，去除細胞培養液，每孔加入1 ml無血清培養基稀釋的DCFH-DA熒光探針(10 μmol/L)孵育20 min，PBS洗滌3次，熒光顯微鏡觀察染色情況并隨機選取視野拍照，每個視野細胞總數大于1 000個。觀察結束后，胰蛋白酶消化收集細胞，并置于流式管中用于流式細胞儀檢測。

1.6 TEM觀察自噬的產生

Caki-1細胞以2.5×10個/ml接種于6孔板，貼壁后加入藥物定容至2 ml，并設置自噬對照組。培養24 h后，細胞刮收集細胞。加入電鏡固定液重懸后4 ℃固定12 h，室溫下2%四氧化鋨固定1 h。細胞用梯度乙醇分級脫水并包埋在環氧樹脂中，將樣品切成超薄切片并染色后TEM觀察。

1.7 Western blot檢測標志蛋白

RIPA裂解液提取各組細胞蛋白，加入上樣緩沖液后沸煮15 min使蛋白徹底變性。在電泳緩沖液中進行聚丙烯酰胺凝膠電泳后，將蛋白質轉移至硝酸纖維素膜(NC膜)上，含5%脫脂奶粉的TBST封閉1 h，加入1 ∶500的LC3一抗或1 ∶500的GAPDH一抗，4 ℃過夜，TBST洗5次，加相應二抗孵育1 h，TBST洗膜5次后顯色發光。

2 結果

2.1 ZF NPs的理化表征

TEM結果顯示，ZF NPs的尺寸形貌為長約20 nm的納米短棒；由于材料表面有聚乙二醇修飾，該納米短棒可很好地分散在水溶液中；動態光散射分析顯示，ZF NPs的粒徑分布信息與TEM觀察到的納米棒的尺寸吻合，稍大的粒徑對應若干個納米棒的堆疊；X射線衍射圖譜顯示ZF NPs各衍射峰的峰位與ZnFeO標準卡片JCPDS (22-1012)的(311)、(400)、(422)、(511)衍射峰位置一致，樣品符合尖晶石型結構的ZnFeO；室溫條件下磁學性能測試顯示ZF NPs具有良好的順磁性。見圖1。

2.2 ZF NPs對Caki-1細胞的生長抑制作用

不同濃度(1、5、10、11、12、13、14、15 μg/ml)ZF NPs處理Caki-1細胞24 h，MTT結果顯示，細胞活力隨ZF NPs濃度的增加而下降(

F

=414.0，

P

<0.01)；14 μg/ml的ZF NPs分別處理細胞6、12、24 h，細胞活力隨著時間的延長而下降(

F

=289.1，

P

<0.01)。見圖2。

圖1 ZF NPs理化表征

2.3 ZF NPs誘導ROS殺傷Caki-1細胞

不同濃度(1、5、10、14 μg/ml)ZF NPs處理Caki-1細胞6 h后，DCFH-DA染色顯示，隨著ZF NPs濃度的提高，ROS的積累在不斷增加；14 μg/ml的ZF NPs分別處理Caki-1細胞1、2、4、6 h后顯示，ROS的積累隨著時間的延長也在增加，見圖3。N-乙酰-L-半胱氨酸(N-Acetyl-L-cysteine, NAC)是一種含巰基的抗氧化劑，可保護細胞免受氧自由基的損害。將5 mmol/L的NAC與14 μg/ml的ZF NPs聯合處理細胞6 h，ROS的積累減少；相同濃度下NAC與ZF NPs聯合處理細胞24 h后，MTT結果顯示，ZF NPs單獨處理后Caki-1細胞的細胞活力為(59.81±3.95)%，而ZF NPs+NAC組的細胞活力為(80.93±3.24)%，高于ZF NPs單獨處理組，差異有統計學意義(

F

=82.07，

P

<0.01)。見圖4。

2.4 ZF NPs誘導促死亡自噬殺傷Caki-1細胞

自噬是一個吞噬自身細胞質蛋白或細胞器并將其包裹進入囊泡，與溶酶體融合形成自噬溶酶體，降解其包裹內容物的過程。因此，通過TEM觀察到自噬泡是檢測自噬產生的金標準。使用14 μg/ml ZF NPs處理Caki-1細胞24 h后，TEM顯示Caki-1細胞中自噬泡數量增多(圖5A紅箭頭所示)。當自噬發生時，存在于胞質中的微管相關蛋白輕鏈3(microtubule associated protein 1 light chain 3，LC3)一型(LC3-I)會被特異性地剪切成綁定在自噬體膜上的LC3-Ⅱ，故LC3-Ⅱ蛋白積累水平的高低代表了自噬水平的高低。使用14 μg/ml 的ZF NPs處理Caki-1細胞6 h后，Western blot結果顯示，LC3-Ⅱ蛋白的積累增多，將1 μmol/L的自噬抑制劑渥曼青霉素(wortmannin，Wort)與14 μg/ml的ZF NPs聯合處理細胞6 h后，LC3-Ⅱ蛋白的積累則減少(

F

=21.90，

P

<0.01)。

圖2 ZF NPs對Caki-1細胞活力的影響

圖3 DCFH-DA 染色觀察ZF NPs誘導Caki-1細胞產生ROS ×100

圖4 NAC對ZF NPs殺傷Caki-細胞的抑制作用

使用14 μg/ml的ZF NPs分別與Wort(1 μmol/L)、自噬增強劑海藻糖(Trehalose)(50 mmol/L)共處理24 h后，MTT結果顯示，相較于ZF NPs單獨處理組，ZF NPs+Wort組的細胞活力回升(

F

=18.98，

P

<0.01)；而ZF NPs+Trehalose組的細胞活力則下降(

F

=476.6，

P

<0.01)，見圖5。

2.5 ZF NPs誘導ROS及促死亡自噬交互調控殺傷Caki-1細胞

14 μg/ml的ZF NPs與50 mmol/L的Trehalose聯合處理Caki-1細胞時，分別加入Wort(1 μmol/L)、NAC(5 mmol/L)，6 h后熒光顯微鏡和流式細胞儀檢測各組ROS含量，結果顯示，ZF NPs+Trehalose組內ROS的積累較ZF NPs組增加，ZF NPs+Trehalose+NAC組和ZF NPs+Trehalose+Wort組內ROS的積累則減少。而24 h后MTT結果顯示，ZF NPs+Trehalose+NAC組和ZF NPs+Trehalose+Wort組細胞活力分別為(70.79±0.81)%和(72.63±2.29)%，相較于ZF NPs+Trehalose處理組(24.49±5.53)%，細胞活力均回升，且差異有統計學意義(

F

=196.5，

P

<0.01)。同時，Western blot結果顯示，相較于ZF NPs組，ZF NPs+NAC組的LC3-Ⅱ蛋白的積累減少(

F

=149.2，

P

<0.01)，而ZF NPs+Trehalose組的LC3-Ⅱ蛋白進一步增多，并且與ZF NPs+Trehalose組相比，Wort和NAC均可減少細胞內LC3-Ⅱ蛋白的積累(

F

=67.56，

P

<0.01)。見圖6。

3 討論

腎透明細胞癌是最常見的腎臟惡性腫瘤，早期腎癌患者可接受手術治療，而轉移性腎癌患者的治療手段則較少。盡管5年相對生存率現有所改善，但總體而言預后仍然很差。近年來，將納米材料應用于癌癥的診療越來越受到研究者的青睞。例如：氧化鐵納米顆粒可作為MRI造影劑，用于多種癌癥的診斷。氧化鋅納米顆粒可作為一種多靶點的納米載體，對腫瘤的治療具有深遠的影響。ZF NPs結合了上述兩種納米材料優異的理化特性，但ZF NPs在腫瘤中的研究并不多見。因此，本研究合成了尺寸均一的水分散ZF NPs，一方面ZF NPs具備順磁性，并可通過“滲透與滯留增強效應”在腫瘤組織中累積，有望作為MRI造影對比劑輔助腎癌診斷；另一方面，ZF NPs可作為藥物直接或增敏殺傷腎癌細胞，有望解決腎癌患者對化療藥物不敏感的難題。

圖5 ZF NPs誘導Caki-1細胞產生自噬效應以及ZF NPs與自噬抑制或增強劑對Caki-1細胞活力的影響

本研究重點評估了ZF NPs對Caki-1細胞的生長抑制作用，顯示ZF NPs對Caki-1細胞的生長抑制作用具有劑量和時間依賴性。ROS是線粒體呼吸的副產物，現被認為是納米顆粒引起細胞死亡的誘因之一。結果表明，ZF NPs誘導Caki-1細胞產生的ROS是引起Caki-1細胞死亡的重要原因，并且ROS清除劑可有效抑制該過程。

自噬是溶酶體介導的降解過程，用于清除受損的細胞器、異常聚集的蛋白質和侵入的病原體，幾乎在每個哺乳動物細胞中都以低水平狀態運轉，在維持細胞的穩態和促進細胞的存活中起著至關重要的作用。細胞在受到物理、化學或生物等刺激后，可應激性地提升細胞內的自噬水平，而這種被誘導的自噬可分為促進細胞存活或加速細胞死亡兩種情況。大量研究表明，納米材料作為一類獨特的自噬誘導劑，可將細胞自噬水平由本底低水平提升到較高水平。雖然部分納米材料能夠引起抑制細胞死亡的自噬，即促生存自噬，但在多數情況下，由納米材料誘導的自噬會促進細胞死亡，即促死亡自噬。因此，不同的納米材料在不同的細胞中誘導的自噬對細胞命運的影響不可一概而論。本研究利用TEM以及Western blot探究ZF NPs能否誘導Caki-1細胞產生自噬以及自噬的類型。結果表明，ZF NPs可誘導Caki-1細胞產生自噬效應，并且自噬強度的抑制或增強，可直接調控ZF NPs的腫瘤細胞殺傷效應。而細胞的自噬水平與細胞活力存在負相關性，因此，ZF NPs可誘導Caki-1細胞產生促死亡型細胞自噬。

綜上所述，ZF NPs可誘導ROS及促死亡自噬殺傷Caki-1細胞。ROS在自噬激活中起著至關重要的作用，但具體調控機制仍不清楚。因此，為進一步探究兩者在ZF NPs殺傷Caki-1細胞過程中的調控關系，課題組首先檢測在自噬水平升高的情況下，Caki-1細胞內ROS的情況，隨后繼續探究Caki-1細胞內ROS清除與自噬水平改變的關聯。結果表明，ZF NPs可通過誘導促死亡自噬進而促進ROS的積累以殺傷Caki-1細胞，而ROS的積累又可進一步提升促死亡自噬強度進而殺傷Caki-1細胞。由此可見，ZF NPs在殺傷Caki-1細胞的過程中誘導ROS及促死亡自噬的產生，并且兩者在這一過程中可交互調控、相互促進，進而有效地殺傷腫瘤細胞。

圖6 ZF NPs誘導ROS及促死亡自噬交互調控殺傷Caki-1細胞