小鼠肝癌細胞外泌體對樹突狀細胞成熟與功能的影響

許偉兵，范璐璐

肝細胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是嚴重危害全人類健康的惡性腫瘤之一，目前手術治療是肝細胞癌的主要治療方法，但由于大部分患者常診斷于疾病的中晚期，只能進行介入治療、放化療、藥物靶向治療等綜合治療，其療效不盡如人意。近來免疫治療因其顯著的療效和創新型為肝細胞癌治療帶來了新的突破，其中以樹突狀細胞(dendritic cells, DCs)為基礎的免疫治療是目前HCC的研究熱點。

近年來有學者研究證明腫瘤來源的外泌體(tumor-derived exosome，TDE)可以通過調節腫瘤的免疫微環境來發揮作用。但其在DC中的作用及功能目前尚不清楚。該研究首先通過小鼠肝癌細胞來源外泌體致敏DCs，觀察其表面類分子的表達，并將致敏DCs與T淋巴細胞共同孵育，觀察小鼠T淋巴細胞的增殖分裂情況，為基于DCs的HCC的免疫治療提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料

C57小鼠肝癌細胞Hepa1-6、樹突狀細胞DC2.4購自中科院上海細胞庫。胎牛血清(FBS)購自美國Gibco公司；高糖DMEM和低糖DMEM購自美國Hyclone公司；ExoQuick-TC外泌體提取試劑盒購自美國的System Biosciences公司。兔來源Anti-CD63、Anti-TSG10、Anti-Cytochrome C單克隆抗體購自美國Abcam公司；抗體FITC anti-Mouse CD86、PerCP/Cy5.5 anti - Mouse CD80、PE anti-Mouse CD83、APC anti-Mouse CD40、Brilliant Violet 650 anti - Mouse MHC-Ⅱ購自美國 Biolegend 公司。實驗過程中需要的去外泌體的血清通過超速離心機去除(34 000 r/min 14 h)，0.22 mm的過濾器過濾。胰酶消化液、BCA蛋白濃度檢測試劑盒和1%青霉素-1%鏈霉素(雙抗)溶液購自中國上海碧云天科技有限公司。

1.2 方法

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細胞培養 將小鼠Hepa1-6細胞，用10%的FBS和濃度為1%雙抗溶液，培養于含4.5 g/L D-葡萄糖的培養基中；將小鼠DC2.4細胞用10%的FBS和雙抗溶液培養于含1g/L D-葡萄糖的培養基中，置于37 ℃、5% CO的培養箱中，換液時間為1～2 d，在對數生長期進行實驗。

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外泌體提取方法 將Hepa1-6細胞于對數生長期時換不含外泌體的FBS培養，48 h后收集Hepa1-6細胞培養上清液，在4 ℃離心機中 5 982 r/min離心15 min去除凋亡細胞以及細胞碎片，在收集的上清液中加入外泌體提取液并充分混勻，置于4 ℃冰箱中12 h，第2天取出，在4 ℃離心機上2 991 r/min 30 min，棄掉上清液，再次 2 991 r/min、4 ℃離心5 min，棄掉上清液，用300 μl PBS重懸離心沉淀。BCA蛋白定量，樣本分裝于-80 ℃冰箱保存。

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外泌體的鑒定 通過透射電子顯微鏡觀察外泌體形態，用1×PBS稀釋外泌體樣本，取外泌體懸浮液20 μl于封口膜上，將銅片放入20 μl樣本液中，并在室溫下放置5 min，晾干。PBS沖洗后，用濾紙吸去殘余液體，反復沖洗3次后，再將銅片插入30 μl醋酸雙氧鈾中，并放置在封口膜上，室溫下染色(3 min)，濾紙吸干殘余的染料，用PBS反復沖洗銅片3次，室溫下干燥銅片30 min，電鏡下觀察外泌體形態。

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蛋白提取和Western blot檢測外泌體的標記蛋白 提取蛋白：收集細胞于EP管中，加入RIPA蛋白裂解液(含PMSF溶液)，4 ℃用旋轉儀充分接觸裂解30 min，低溫4 ℃離心機，10 000 r/min、10 min離心，去沉淀，用BCA試劑盒測定樣品中的蛋白含量。通過SDS-PAGE檢測蛋白質樣品，在恒定電流(350 mA)下通過濕轉法1.5 h，轉移到PVDF膜上，使用5%BSA封閉，分別加入一抗(1 ∶1 000)： Anti-CD63、Anti-TSG101、Cytochrome C，4 ℃孵育過夜。室溫孵育二抗(1 ∶4 000)2 h，使用化學發光成像儀進行成像顯影。

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外泌體沖擊DC2.4細胞 培養DC2.4細胞，分別加入PBS、外泌體(20 μg/ml)、LPS(1 μg/ml)，于12孔板中繼續培養48 h。經PBS、EXO、LPS體外沖擊致敏的DC2.4細胞分別命名為iDC、DC-EXO、DC-LPS。

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DC2.4表面分子染色及流式細胞儀檢測 收集不同處理組的DC2.4細胞于EP管中，1×PBS沖洗2次，然后在各管分別加入90 μl封閉液，在4 ℃環境中避光封閉15 min。然后于每管中加入熒光標記抗體FITC anti-Mouse CD86、PerCP/Cy5.5 anti-Mouse CD80、PE anti-Mouse CD83、APC anti-Mouse CD40、Brilliant Violet 650 anti - Mouse MHC-Ⅱ，在4 ℃環境中孵抗體30 min后用PBS反復沖洗3次，在每管加入DAPI后進行流式儀檢測細胞。

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外泌體致敏DCs對T淋巴細胞增殖的影響 在超凈臺下取C57BL/6成年健康小鼠的脾臟，充分裂解以去除紅細胞，反復洗滌后制成單個細胞的懸液；然后采用免疫磁珠分離法來獲得小鼠的T淋巴細胞，將CFSE標記的T淋巴細胞和各處理組DCs按5 ∶1比例共孵育5 d。實驗分2組：未用外泌體致敏的DCs與淋巴細胞共孵育組、外泌體致敏后的DCs與淋巴細胞共孵育組。用流式儀來測定不同組T淋巴細胞的分裂增殖情況。

1.3 統計學處理

所得數據采用GraphPad prism 6.0軟件進行統計分析，用

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檢驗方法比較每組數據的差異，以

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<0.05為差異有統計學意義。每項實驗均重復3次。

2 結果

2.1 透射電鏡觀察小鼠Hepa1-6細胞外泌體的形態

通過透射電鏡可清晰地看到，從Hepa1-6細胞的上清液提取的外泌體為雙層膜樣結構，呈圓形或者類圓形，直徑為30～100 nm，大小相對均一，均勻地分布在視野內(×40 000)。見圖1。

圖1 透射電鏡觀察小鼠肝癌細胞外泌體的形態 ×40 000

2.2 Western blot檢測外泌體標志性蛋白

Western blot結果顯示，從Hepa 1-6細胞的上清液中提取的物質有外泌體標志性蛋白CD63、TSG101的表達，但無細胞色素C(Cytochrome C)的表達，表明提取的外泌體中不含有細胞成分，無細胞碎片的污染，為純度較高的外泌體。見圖2。

圖2 Western-blot法檢測外泌體標志性蛋白CD63、

2.3 小鼠肝癌細胞Hepa 1-6來源的外泌體對DC2.4表型的影響

將小鼠Hepa 1-6細胞來源的外泌體與鼠DC2.4細胞共培養48 h后見DC2.4細胞體積增大，半貼壁生長，可在DC2.4細胞邊緣見樹突狀或者偽足樣突起，表明朝向成熟方向分化。流式細胞術檢測顯示，與iDC組相比,外泌體能夠上調DC2.4表面的MHC-Ⅱ、CD80、CD83、CD86 和 CD40 分子的表達(

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<0

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05)，見圖3。并且隨著外泌體濃度的增加，DC2.4表面分子表達增高，見圖4。

圖3 小鼠肝癌細胞來源的外泌體對鼠樹突狀細胞表型的影響

圖4 不同濃度的小鼠肝癌細胞來源的外泌體對鼠樹突狀細胞表型的影響

2.4 小鼠肝癌細胞Hepa1-6來源的外泌體致敏DCs對T淋巴細胞增殖情況的影響

小鼠肝癌細胞Hepa1-6來源的外泌體致敏DCs(成熟DCs)共孵育組誘導刺激初始T淋巴細胞增殖情況高于未用外泌體致敏的DCs(

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=-3.260,

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<0.05)。FITC通道標記的CFSE染料，隨著T淋巴細胞的增值，熒光強度逐漸的減少。見圖5。

圖5 小鼠肝癌細胞來源的外泌體致敏樹突狀細胞

3 討論

基于DC的抗腫瘤免疫治療現已成為HCC治療的研究熱點之一。DC是人體內最重要的抗原提呈細胞(antigen presenting cells，APC)，DC首先對抗原進行識別、攝取和加工，然后將加工處理的抗原多肽片段與主要組織相容性復合體(MHC)以復合物的方式提交給T細胞表面并活化初始T淋巴細胞，進而激活T淋巴細胞的免疫應答反應，在人體抗腫瘤特異性免疫應答的啟動中發揮著至關重要的作用。有研究表明，以DCs為基礎的抗腫瘤免疫治療具有一定的效果，但是HCC患者多數有慢性肝病病史，患者長期處于免疫功能抑制狀態，腫瘤組織內浸潤 DC的功能受抑，無法獲得具有較強特異免疫原性的DC疫苗，嚴重限制了基于DC的疫苗的發展。因此，開發以DCs為基礎的抗腫瘤免疫治療的重點是尋找具有更強的免疫原性，但同時又含有較少免疫抑制性物質的腫瘤抗原。

外泌體是雙層囊泡樣結構的物質，其直徑約為30～100 nm，并由多種活細胞分泌而來。有研究表明外泌體是一種細胞間信號傳遞的重要介質之一，在機體的生理和病理過程中都發揮著重要的作用，在不同惡性腫瘤中也發揮著不同的作用。研究表明TDE既能通過直接作用又可以通過間接作用來影響免疫細胞的成熟和功能，目前尚不清楚其在DC中的作用及功能。本研究結果顯示小鼠肝癌細胞Hepa 1-6來源的外泌體致敏DCs能夠上調其成熟分子的表達，并且隨著外泌體濃度的增加，表面類分子表達增高，同時將致敏的DCs與T細胞共孵育，可促進T淋巴細胞的增殖。提示肝癌細胞Hepa1-6提取的外泌體可提供重要抗原性物質為調節DCs介導抗腫瘤免疫。但腫瘤的外泌體刺激DC成熟并發揮抗腫瘤的機制有待進一步探討。

綜上所述，小鼠Hepa1-6細胞提取的外泌體可促進DC2.4細胞成熟，并刺激T細胞的分裂增殖，為基于DC的HCC免疫治療提供潛在的腫瘤抗原譜，并為基于DCs的抗腫瘤免疫治療提供一定理論依據。