高良姜素對于肺腺癌細(xì)胞增殖、遷移能力的影響

汪 新，束 軍，代麗麗，沈繼龍

腫瘤的十大特征已經(jīng)成為一種共識，其中包括腫瘤細(xì)胞異常的能量代謝以及腫瘤的浸潤和轉(zhuǎn)移。腫瘤細(xì)胞即使在有氧環(huán)境中也無法進(jìn)行有氧氧化，而只能依賴于糖酵解產(chǎn)生少量能量，這一現(xiàn)象稱為瓦博格效應(yīng)，即有氧糖酵解。腫瘤的轉(zhuǎn)移通常發(fā)生在晚期階段，上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)是上皮細(xì)胞失去極性向間質(zhì)轉(zhuǎn)化的過程，對于腫瘤轉(zhuǎn)移起著重要作用。高良姜素(galangin, Ga) 具有一定的抗癌作用，如Ga通過抑制糖酵解來抑制肝癌細(xì)胞的增殖等過程，或通過抑制EMT過程進(jìn)而抑制腎癌細(xì)胞、膠質(zhì)瘤細(xì)胞的進(jìn)展。目前Ga對于肺癌治療的研究罕見，其相關(guān)機制尚無明確定論。該文旨在初步探討Ga對于肺腺癌A549、PC9細(xì)胞增殖、遷移能力的影響及其可能機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

人肺腺癌A549、PC9細(xì)胞由安徽醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院惠贈；Ga(DG0020)購于成都德思特生物技術(shù)有限公司，規(guī)格：20 mg/支；RPMI-1640培養(yǎng)基購于美國HyClone公司；胎牛血清購于杭州四季青生物技術(shù)有限公司；二甲基亞砜(DMSO)購于美國Sigma公司；CCK-8試劑盒(C0038)、青霉素-鏈霉素-兩性霉素B溶液(100X)、胰酶、RIPA裂解液、BCA蛋白濃度測定試劑盒(增強型)(P0010S)購于上海碧云天生物技術(shù)有限公司；乳酸(lactic acid，LD)檢測試劑盒(A019-2-1)、乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)檢測試劑盒(A020-1-2)、ATP檢測試劑盒(A095-1-1)購于南京建成生物工程研究所；人E-鈣黏蛋白(E-cadherin, E-cad)ELISA試劑盒(JYM0034Hu)、人N-鈣黏蛋白(N-cadherin, N-cad)ELISA 試劑盒(JYM0185Hu)購于武漢基因美生物科技有限公司；酶標(biāo)儀購于美國Biotek公司。

1.2 實驗方法

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細(xì)胞培養(yǎng) 肺腺癌A549、PC9細(xì)胞分別置于37 ℃、含有5% CO的細(xì)胞培養(yǎng)箱中，用含有10%胎牛血清、1%抗生素的RPMI-1640培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。肺腺癌細(xì)胞呈貼壁方式生長，視細(xì)胞生長狀態(tài)進(jìn)行換液、傳代。取處于對數(shù)生長期的健康細(xì)胞進(jìn)行實驗。

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2

藥物配制 用DMSO作為溶劑，將Ga溶于其中并配制成藥物溶液，于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩嶒炛懈鹘MDMSO溶劑濃度不超過0.1%。

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CCK-8法檢測不同濃度Ga對于肺腺癌細(xì)胞增殖能力的影響 取處于對數(shù)生長期的健康肺腺癌A549、PC9細(xì)胞，調(diào)整好細(xì)胞濃度進(jìn)行96孔板鋪板，每孔加入100 μl細(xì)胞懸液。細(xì)胞貼壁后0藥對照組加入100 μl培養(yǎng)基，實驗組加入同體積不同濃度Ga(12.5、25、50、100 μmol/L)溶液，各組均設(shè)置5個重復(fù)孔。培養(yǎng)24、48 h后分別加入10 μl CCK-8試劑，調(diào)節(jié)酶標(biāo)儀波長為450 nm進(jìn)行吸光度(optical density，OD)檢測。計算各組細(xì)胞活力，細(xì)胞活力=(實驗組OD值-空白對照組OD值)/(0藥對照組OD值-空白對照組OD值)×100%。DMSO組細(xì)胞活力計算方式與實驗組類似，實驗重復(fù)3次。

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細(xì)胞劃痕實驗檢測不同濃度Ga對于肺腺癌細(xì)胞遷移能力的影響 在6孔板背面沿直尺劃線，每孔3條線。取處于對數(shù)生長期的健康肺腺癌A549、PC9細(xì)胞，調(diào)整好細(xì)胞密度，將細(xì)胞均勻鋪板。在細(xì)胞長滿后，用槍頭垂直于橫線劃痕，用PBS清洗并在顯微鏡下拍照即為0 h劃痕寬度。實驗組分別加入含有不同濃度Ga(12.5、25、50、100 μmol/L)的無血清培養(yǎng)基，對照組加入等量無血清培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h后用PBS清洗并在同一位置拍照，即為24 h劃痕寬度。用ImageJ軟件分析細(xì)胞遷移距離，細(xì)胞遷移率=(0 h劃痕寬度-24 h劃痕寬度)/ 0 h劃痕寬度×100%。實驗重復(fù)3次。

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LD試劑盒檢測Ga對于肺腺癌細(xì)胞上清液中LD生成量的影響 取處于對數(shù)生長期的健康肺腺癌A549、PC9細(xì)胞，調(diào)整為合適細(xì)胞密度，進(jìn)行6孔板鋪板。等細(xì)胞生長至70%左右，去除原培養(yǎng)基并清洗，實驗組加入2 ml不同濃度Ga(12.5、25、50、100 μmol/L)的培養(yǎng)基，對照組加入同體積培養(yǎng)基。24 h后吸取細(xì)胞培養(yǎng)液，離心、收集并用于后續(xù)上清液成分檢測。按照LD測定試劑盒說明書要求分別對空白組、標(biāo)準(zhǔn)組、待測組(0藥對照組及實驗組)加樣，調(diào)節(jié)酶標(biāo)儀波長至530 nm檢測OD值，即可計算LD生成量，細(xì)胞上清液LD生成量=(待測組OD值-空白組OD值)/(標(biāo)準(zhǔn)組OD值-空白組OD值)×標(biāo)準(zhǔn)品濃度(3 mmol/L)×樣本測定前稀釋倍數(shù)。實驗重復(fù)3次。

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LDH試劑盒檢測Ga對于肺腺癌細(xì)胞內(nèi)LDH活性的影響 按照實驗方法1.2.5進(jìn)行細(xì)胞鋪板，24 h后用PBS清洗，加入細(xì)胞裂解液，刮取細(xì)胞并置于4 ℃冰箱裂解30 min后離心，收取上清液用于后續(xù)細(xì)胞內(nèi)成分檢測。根據(jù)BCA蛋白檢測試劑盒說明書加蛋白標(biāo)準(zhǔn)品及待測細(xì)胞內(nèi)成分，調(diào)節(jié)酶標(biāo)儀波長至562 nm檢測OD值，檢測待測組(0藥對照組及實驗組)細(xì)胞BCA蛋白表達(dá)水平以備后用。按照LDH測定試劑盒說明書要求對標(biāo)準(zhǔn)組、空白組、待測組(0藥對照組及實驗組)、對照組加樣，調(diào)節(jié)酶標(biāo)儀波長至440 nm檢測OD值，即可計算LDH活性，LDH活性=(待測組OD值-對照組OD值)/(標(biāo)準(zhǔn)組OD值-空白組OD值) ×標(biāo)準(zhǔn)品濃度(2 mmol/L)×樣本測定前稀釋倍數(shù)/待測樣本蛋白濃度。實驗重復(fù)3次。

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ATP測定試劑盒檢測不同濃度Ga對于肺腺癌細(xì)胞內(nèi)ATP生成量的影響 參照實驗方法1.2.6提取肺腺癌細(xì)胞內(nèi)成分，計算待測組(0藥對照組及實驗組)細(xì)胞BCA蛋白表達(dá)水平以備后用。按照ATP含量測定試劑盒說明書要求對空白組、標(biāo)準(zhǔn)組、待測組、對照組加樣，調(diào)節(jié)酶標(biāo)儀波長至636 nm檢測OD值，即可計算ATP生成量，ATP生成量=(待測組OD值-對照組OD值)/(標(biāo)準(zhǔn)組OD值-空白組OD值)×標(biāo)準(zhǔn)品濃度(10μmol/L)×樣本測定前稀釋倍數(shù)/待測樣本蛋白濃度。實驗重復(fù)3次。

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人E

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cad與N

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cad ELISA試劑盒檢測細(xì)胞上清液中E

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cad與N

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cad蛋白量 參照實驗方法1.2.5收集肺腺癌細(xì)胞上清液，按照ELISA試劑盒說明書要求對空白組、標(biāo)準(zhǔn)組、待測組(0藥對照組及實驗組)進(jìn)行加樣，調(diào)節(jié)酶標(biāo)儀波長為450 nm測定各孔OD值，用空白孔調(diào)零。以標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫軸、OD值為縱軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出待測樣品濃度，再乘以稀釋倍數(shù)即為E-cad、N-cad蛋白表達(dá)量。實驗重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1 Ga抑制肺腺癌A549、PC9細(xì)胞的增殖

與0藥對照組相比，實驗組用不同濃度的Ga分別處理A549、PC9細(xì)胞24、48 h后，細(xì)胞出現(xiàn)不同程度的增殖抑制現(xiàn)象，而DMSO溶劑對照組對細(xì)胞活力的組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義。24 h(A549：

F

=14.60；PC9：

F

=21.06)檢測結(jié)果顯示，與0藥對照組相比，實驗組中低濃度Ga(12.5、25 μmol/L)對于A549、PC9細(xì)胞的細(xì)胞活力影響差異無統(tǒng)計學(xué)意義，而較高濃度組Ga(50、100 μmol/L)抑制兩種細(xì)胞的細(xì)胞活力，組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(

P

<0.05)。48 h(A549：

F

=127.49；PC9：

F

=85.75)結(jié)果表明，實驗組Ga對于兩種細(xì)胞的增殖抑制作用差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(

P

<0.05)。此外，在高濃度組Ga中，Ga處理細(xì)胞時間越長，細(xì)胞增殖抑制作用越強(

P

<0.05)。綜上，Ga對于肺腺癌A549、PC9細(xì)胞的增殖有抑制作用(圖1)。

2.2 Ga抑制肺腺癌A549、PC9細(xì)胞的遷移

與0藥對照組相比，實驗組用不同濃度Ga(12.5、25、50、100 μmol/L)作用于肺腺癌細(xì)胞24 h(A549：

F

=141.87；PC9：

F

=223.94)，細(xì)胞出現(xiàn)不同程度的遷移抑制現(xiàn)象，細(xì)胞遷移率的組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義

P

<0.05(圖2)。

2.3 Ga抑制肺腺癌A549、PC9細(xì)胞LD生成、LDH活性及ATP生成

與0藥對照組相比，實驗組用不同濃度Ga(12.5、25、50、100 μmol/L)作用于肺腺癌A549、PC9細(xì)胞24 h，LD生成量均逐漸降低，組間差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(A549：

F

=320.12，

P

<0.05；PC9：

F

=327.61，

P

<0.05)；LDH活性逐漸越低，組間差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(A549：

F

=153.53，

P

<0.05；PC9：

F

=193.69，

P

<0.05)；ATP生成量出現(xiàn)不同程度降低，除低濃度組Ga(12.5 μmol/L)對于A549細(xì)胞組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義外，其余組間差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(A549：

F

=87.13，

P

<0.05；PC9：

F

=58.04，

P

<0.05)(表1、2)。

圖1 Ga對于肺腺癌A549、PC9細(xì)胞增殖能力的影響

表1 不同濃度Ga對于肺腺癌A549細(xì)胞LD生成量、LDH活性、ATP生成量及E-cad、N-cad蛋白表達(dá)量的影響

表2 不同濃度Ga對于肺腺癌PC9細(xì)胞LD生成量、LDH活性、ATP生成量及E-cad、N-cad蛋白表達(dá)量的影響

圖2 Ga對于肺腺癌A549、PC9細(xì)胞遷移能力的影響 ×100

2.4 Ga促進(jìn)肺腺癌A549、PC9細(xì)胞E-cad生成、抑制N-cad生成

與0藥對照組相比，實驗組用不同濃度Ga(12.5、25、50、100 μmol/L)作用于肺腺癌A549、PC9細(xì)胞24 h，上清液E-cad蛋白表達(dá)量逐漸增高，組間差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(A549：

F

=195.38，

P

<0.05；PC9：

F

=160.24，

P

<0.05)；而N-cad蛋白表達(dá)量逐漸降低，組間差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(A549：

F

=260.44，

P

<0.05；PC9：

F

=258.79，

P

<0.05)(表1、2)。

3 討論

肺癌是全球發(fā)病率、死亡率居高位的癌癥，目前尚無特效治療。對于肺癌的治療方式主要包括手術(shù)、放療、化療、靶向治療等，但均存在一定的弊端。為了更好地治療肺癌，提高肺癌患者的生存率，國內(nèi)外研究者開始研究一些具有抗癌活性的純天然化合物，Ga就是其中一種。Ga是從中藥材高良姜的根莖中提取出的黃酮類化合物，具有廣泛的生物活性如抗炎、抗氧化等。Ga還具有一定的抗癌作用，可以通過不同的途徑抑制腫瘤細(xì)胞的進(jìn)展如肝癌、腎癌、膠質(zhì)瘤，但是Ga對于肺癌治療的研究罕有報道。本研究用不同濃度的Ga處理肺腺癌A549、PC9細(xì)胞，初步探討其對于肺腺癌細(xì)胞增殖、遷移能力的影響以及可能的作用機制。本研究表明，Ga抑制肺腺癌細(xì)胞的增殖和遷移能力，且呈現(xiàn)一定的濃度依賴性和時間依賴性。

腫瘤細(xì)胞的能量代謝失衡是腫瘤細(xì)胞區(qū)別于正常細(xì)胞的特征之一。腫瘤細(xì)胞的生長依賴于糖酵解并在LDH的作用下生成少量能量以滿足代謝需要。多種生物組分參與其中，如LDH、LD、葡萄糖、ATP等。研究顯示腫瘤細(xì)胞的糖酵解與細(xì)胞增殖密切相關(guān)。本研究中，Ga處理肺腺癌細(xì)胞后，細(xì)胞的LDH活性降低，LD和ATP的生成量降低，并且均與Ga濃度有關(guān)，這提示Ga有可能是通過抑制腫瘤細(xì)胞的糖酵解，降低細(xì)胞能量供應(yīng)，進(jìn)而抑制腫瘤細(xì)胞增殖。

腫瘤的轉(zhuǎn)移是另一特征，指的是腫瘤從原發(fā)部位轉(zhuǎn)移到其他部位并形成新的腫瘤的過程。EMT是上皮細(xì)胞向間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化，使其失去細(xì)胞間黏附作用，以提高細(xì)胞活動性的過程。EMT被認(rèn)為是腫瘤轉(zhuǎn)移中的主要因素。目前已知的EMT標(biāo)志蛋白主要包括上皮標(biāo)志蛋白E-cad以及間質(zhì)標(biāo)志蛋白N-cad、vimentin(VIM)，并且EMT抑制過程常表現(xiàn)為E-cad表達(dá)量增高而N-cad、VIM表達(dá)量降低。本研究顯示，當(dāng)作用于肺腺癌細(xì)胞的Ga濃度逐漸增加時，E-cad蛋白表達(dá)量逐漸增高，而N-cad的表達(dá)量逐漸降低，這提示Ga有可能通過抑制EMT過程進(jìn)而抑制肺腺癌細(xì)胞的遷移能力。

Yang et al研究表明胃癌細(xì)胞的增殖、遷移與糖酵解密切相關(guān)。Cao et al發(fā)現(xiàn)肺癌細(xì)胞外ATP能促進(jìn)細(xì)胞遷移、侵襲，并且誘導(dǎo)基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMPs)、EMT相關(guān)蛋白等表達(dá)。Hou et al發(fā)現(xiàn)抑制肺癌細(xì)胞LDH-A的表達(dá)能夠抑制EMT過程，伴有E-cad表達(dá)增加而VIM、N-cad等表達(dá)降低。細(xì)胞的生命活動離不開能量，而腫瘤細(xì)胞的能量代謝則依賴于糖酵解。結(jié)合本研究，Ga對于肺腺癌細(xì)胞遷移能力的影響可能不僅與EMT有關(guān)，還與糖酵解有關(guān)，但相關(guān)機制仍需進(jìn)一步探討。