不同碘營養水平對大鼠RASSF1A基因甲基化的影響

汪靚婧，董小婉，吳 翌，許 敏，王佑民

碘對維持正常的甲狀腺功能起重要作用，高碘和低碘都會增加甲狀腺疾病的發生率。缺碘會造成碘缺乏病，高碘會造成高碘性甲狀腺腫、甲狀腺功能亢進和自身免疫性甲狀腺炎等疾病。目前, 碘的負效應成為內分泌學界和地方病學界共同關注的問題。Ras相關區域家族1 A(ras-association domain family 1A, RASSF1A)是一個位于人類3號染色體短臂(3p21.3)上的抑癌基因。RASSF1A基因幾乎在所有組織中都有表達，近年來，RASSF1A基因甲基化在肝癌、肺癌、胃癌、乳腺癌、甲狀腺癌等腫瘤疾病中的研究日益增多。目前，有關不同碘營養水平對RASSF1A基因甲基化影響尚未見報道。該研究采用動物實驗方法，對不同碘飼養狀態的大鼠RASSF1A基因甲基化率進行了對比分析，以探討RASSF1A基因甲基化與碘營養狀態的關系。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

主要試劑：碘化鉀試劑(天津市凱通化學試劑有限公司)，血清游離三碘甲腺原氨酸(free 3,5,3′-L-triiodo-thyronine, FT3)、游離甲狀腺激素(free 3,5,3′,5′-L-tetraiodo-thyronine, FT4)、促甲狀腺激素(thyroid stimulating hormone, TSH)檢測試劑盒(德國西門子醫學診斷股份有限公司)，基因組甲基化處理試劑(德國Qiagen生物公司)、組織基因組提取試劑盒和凝膠回收試劑盒(天根生化科技有限公司)。主要儀器：純水儀(杭州中燦科技有限公司)，德國西門子醫學診斷有限公司化學免疫分析儀(型號: ADVIA centaur XP)，電泳儀(北京六一儀器公司)，PCR擴增儀(Eppendorf 公司)。

1.2 動物分組與建模

選取40只SPF級雌性SD大鼠(日齡35～40 d, 體質量150～170 g)，購自安徽醫科大學動物實驗中心，合格證號：NO. 340000200001326。40只大鼠隨機均分為5組：低碘(LI)組、正常碘(NI)組、5倍高碘(5HI)組、10倍高碘(10HI)組、20倍高碘(20HI)組。均飼以低碘飼料(含碘量<50 μg/kg)。根據國內學者總結的經驗，完善大鼠碘過量及碘缺乏模型構建。LI組飲用去離子水(含碘量0 μg/L)，余各組飲用加KI的去離子水。以大鼠每日進食20 g，進水20 ml估計每只大鼠每日的總攝碘量，分別為LI組<1.00 μg; NI組6.15 μg; 5HI組30.75 μg; 10HI組61.50 μg; 20HI組123.00 μg。每個月收集1次各組大鼠24 h尿樣，采用 ICP-MS(電感耦合等離子體質譜法)測定每組的尿碘水平，評價各組的碘營養狀態。飼養3個月后處死大鼠，留取動脈血和甲狀腺標本。血標本送至內分泌科實驗室，采用化學發光免疫分析方法測定血清FT3、FT4、TSH水平。

1.3 甲基化率測定

亞硫酸氫鹽處理后測序法進行檢測。在Genebank內檢索出大鼠RASSF1A的基因序列(GenBank ID: 363140)，經MethPrimer軟件檢測，大鼠RASSF1A基因啟動子區域共有2個符合條件的CpG島(見圖1)，分別記為C1和C2。C1的序列長度為281 bp，包含11個CpG位點，C2的序列長度為448 bp，包含44個CpG位點。RASSF1A的引物設計見表1。PCR反應體系30 μl，上下游引物均各為1 μl，擴增條件為95℃預變性10 min，94 ℃、30 s，55 ℃、30 s，72 ℃、40 s，40循環，72 ℃延伸5 min。用2%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。

表1 引物信息

2 結果

2.1 不同碘營養狀態與尿碘的關系

Spearman分析顯示，各組大鼠的平均尿碘與碘攝入成正相關(

r

=+0.598,

P

=0.021)。但與NI組比較，各高碘組平均尿碘并未達到相應的倍數差，見表2。

表2 各組大鼠尿碘

2.2 不同碘營養狀態與血清甲狀腺激素水平的關系

飼養3個月后，FT3與碘濃度呈負相關(

P

<0.05)。而FT4、FT3/FT4、TSH與碘濃度差異均無統計學意義。但從總的變化趨勢上看，低碘組和高碘組FT3均較NI組降低，結果差異有統計學意義。FT4均較NI組升高，但差異無統計學意義，TSH各組間未見顯著變化趨勢，見表3。

表3 大鼠血清甲狀腺激素水平變化

2.3 不同碘營養狀態與RASSF1A基因啟動子區甲基化的關系

設定各CpG島的平均甲基化率=CpG島甲基化的CpG個數/該CpG島總 CpG 個數；總甲基化率=(C1甲基化的CpG個數+C2甲基化的CpG個數)/(C1+C2總CpG個數)，經不同碘營養處理3個月后，BSP法檢測顯示，無論實驗組還是對照組，在C1區域均呈現較高程度的甲基化，在C2區域則呈現較低程度的甲基化。各碘濃度組與正常碘組對比，無論C1啟動子區域(

P

=0.630)、C2啟動子區域(

P

=0.401)還是總的啟動子區域(

P

=0.398)甲基化率，差異均無統計學意義，見表4。但通過繪制線型圖，從總體趨勢上看無論低碘組還是高碘組，各啟動子區域的甲基化率均比正常組低，且在C1區域甲基化率從5倍高碘到20倍高碘呈現先降低后升高的U型趨勢，見圖2。

3 討論

碘對甲狀腺激素合成的作用受碘攝入量及作用時間影響，碘過量早期時機體存在一定代償功能，甲狀腺上皮通過鈉-碘轉運體等自主調節方式減少對碘的攝取，以調控激素的合成與釋放，但長期碘過量也會出現失代償。碘缺乏早期，在組織脫碘酶的作用下T4會更多的轉化為T3，這種轉化具有明顯的適應代償意義，但長期碘缺乏會使機體T3降低，最終出現甲減表現。本研究中LI組FT3較NI組降低，FT4比FT3升高，考慮存在早期的失代償。而高碘的調控機制相對復雜，秦貴軍 等對小鼠高碘飼養5個月后，本研究結果與之相似，高碘組的FT3低于正常組，而FT4高于正常組，作者認為這種現象可能與碘抑制5′-脫碘酶，從而阻止T4向T3分解有關，且這種抑制超過了高碘對甲狀腺激素釋放的抑制，故未出現特征性T3、T4降低，反饋TSH升高的血清改變。

圖1 大鼠RASSF1A基因啟動子區域的BSP分析結果

表4 各組基因甲基化比率

圖2 各組甲基化率均值線性圖

目前關于碘營養水平對基因甲基化影響的研究甚少，僅在近年略有增加趨勢。Kim et al通過對臨床患者進行尿碘采集，將患者分成不同的碘營養狀態組，發現低碘和高碘攝入都是導致BRAF基因突變的危險因素。Guo et al嘗試通過動物造模的方法去探究碘過量是否會影響小鼠甲狀腺T淋巴細胞和B淋巴細胞DNA甲基轉移酶(DNA Methyltransferases, DNMTs)的表達。結果在對比高碘和對照組后，DNMT基因的甲基化率、mRNA和蛋白表達水平均未見顯著差異。但Serrano-Nascimento et al通過細胞實驗得出了相反的觀點，他們認為碘過量可以使DNMTs表達增加，且伴隨組蛋白H3的高甲基化和低乙酰化。在有限的關于碘與基因甲基化的研究中，可知碘可能會對BRAF和組蛋白H3基因甲基化造成影響。RASSF1A是近年來研究較熱門的一個抑癌基因，目前認為它的抑癌作用可能與導致細胞周期停滯、促進細胞凋亡和降低腫瘤細胞的致瘤相關。RASSF1A啟動子區域甲基化與甲狀腺癌的易感性和無病生存率密切相關，是甲狀腺腫瘤發生的一個早期步驟。現有的研究表明吸煙、病毒感染、過量雌二醇、氯乙烯和鎳暴露等會對RASSF1A基因甲基化造成影響。但關于碘對RASSF1A基因甲基化的影響仍是未知的。

本實驗結果存在3種可能：①碘與RASSF1A基因甲基化無關。既往已有研究表明小鼠在3個月的高碘誘導下DNMTs表達組間無明顯差異。DNMTs是機體調節基因甲基化的重要途徑，基因甲基化率增減可能伴隨一定DNMTs改變。在此基礎上可以推測，短期低或高碘與RASSF1A基因甲基化無關。但影響基因甲基化的因素不止DNMTs，還包括miR和基因間相互影響，故存在另一種可能。②碘可以影響RASSF1A基因甲基化，但目前處于代償期。基因甲基化會受到感染物種類、濃度和感染時間的影響。國內學者在用氯乙烯染毒大鼠早期未發現陽性差異，延長染毒時間后，高劑量組RASSF1A基因才出現甲基化率升高，且呈先降后增的趨勢。本實驗在飼養3個月后，C1、C2區域無論高碘還是低碘組，甲基化率都比正常組低，C2區域高碘組甲基化率呈現先降后增的U型趨勢。這與續志斌 等和張慧霞的實驗結果有類似之處。作者也對這種“反常”的降低做了推測，在染毒早期機體通過DNMTs、miR等的異常表達，使啟動子區甲基化水平下降，從而發揮基因的抑癌作用。故染毒早期不一定表現甲基化率升高，反而可以因為抑癌作用出現甲基化率下降。③其他因素：不同腫瘤存在不同的甲基化熱點位點。Volodko et al認為RASSF1A基因在乳腺癌中甲基化熱點僅限于11個CpG位點，余與乳腺癌的發生無關。張杰興發現RASSF1A第104位CpG是鎘促進人肝癌細胞增殖的關鍵點。碘是否僅對甲狀腺特定CpG位點產生影響仍有待如焦磷酸測定等定量檢測去進一步判斷。

綜上所述，在用不同碘濃度飼養SD大鼠3個月后，各組大鼠的血清FT3值隨著碘濃度升高而降低，但FT4、TSH值在各組間無明顯差異。3個月的碘誘導，各組間RASSF1A基因甲基化率差異無統計學意義，碘可能對RASSF1A基因甲基化無影響或機體處于代償期。