hUC-MSCs對缺氧缺血腦損傷新生大鼠腦組織的保護作用研究

陳茂瓊，向 敏，宋海良，王 嵐，匡夢嵐，張麗娟，熊 英，何志旭，許鍵煒，高 鴻，秦 臻

圍生期多種因素引起的缺氧、腦血流減少而致的新生兒缺氧缺血性腦病(hypoxic ischemic encephalopathy，HIE)是新生兒死亡和嬰兒神經系統功能障礙的主要原因，研究表明，HIE通過氧化應激、炎癥、凋亡和興奮性毒性導致延遲的細胞死亡。目前，亞低溫等常規治療對于缺氧缺血性腦病有一定的療效，但無法逆轉神經細胞損傷。近年來，對間充質干細胞(marrow mesenchymal stem cell，MSCs)，特別是來源更加原始，分化能力更強的人臍帶間充質干細胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells，hUC-MSCs)研究的深入，為HIE的治療帶來了新的希望。研究顯示，MSCs因其具有自我更新和多項分化潛能以及分泌、旁分泌等能力，同時還參與信號通路的調節，對受損組織發揮保護作用。該實驗旨在通過移植hUC-MSCs治療缺血缺氧誘導的新生大鼠HIE，并探討hUC-MSCs對神經細胞的保護作用及機制。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

新生7日齡健康SD大鼠18只，雌雄不限，體質量(15±2)g[貴州醫科大學實驗動物中心，動物合格號SYXK(黔)2018-0001]；新生兒臍帶(貴州醫科大學附屬醫院產科)。相差顯微鏡(德國Leica公司)；CO培養箱(美國Thermo Forma公司)；臺式高速冷凍離心機(Allegra 64R，美國貝克曼庫爾特公司)；CM1950型冰凍切片機(德國徠卡公司)；超凈工作臺(蘇州蘇凈集團)；U-LH100L-3活細胞工作站(日本OLYMPUS公司)。L-DMEM培養基、10%FBS及0.25%胰酶 (美國Hyclone公司)； 2，3，5-氯化三苯基四氮唑(TTC)染色液(北京索萊寶科技有限公司)；TRIzol、轉染試劑(美國Ambion公司)；Q-PCR引物(生工生物工程上海股份有限公司合成)。

1.2 方法

1

.

2

.

1

hUC

-

MSCs的分離、培養及鑒定 采集新生兒長臍帶約10 cm(產婦年齡在20～35歲之間，身體健康，無各種急、慢性疾病。胎兒足月，出生體質量>2 500 g，健康、無畸形)，提取臍帶內保留華爾通膠，剪碎成約1×1×1(mm)大小顆粒，接種于75 cm培養瓶，10%FBS+L-DMEM液適量，置于37℃、5%CO培養箱中培養。3 d后半量換液，以后每3 d全量換液，倒置相差顯微鏡觀察。待細胞融合至50%后去除組織塊，繼續培養；細胞融合至80%左右傳代。傳代純化至第4代，用流式細胞儀進行細胞膜表面分子CD44、CD73、CD90的水平檢測分析，并設立陰性對照。

1

.

2

.

2

動物分組及缺氧缺血腦損傷模型的制備、hUC

-

MSCs的標記及移植治療 將大鼠隨機均分為對照(假手術)組、模型組、治療組。模型組和治療組大鼠用絲線對其左側頸總動脈進行雙重結扎，使其缺血后置于原母鼠籠中2 h，再置于37℃常壓含8%O和92%N混合氣體的低氧艙內，以2 L/min的速度輸入，持續1 h，建立缺氧缺血腦損傷模型。對照組新生大鼠僅分離左側頸總動脈，不予結扎阻斷血流和低氧處理。

選取第三代生長融合至80%左右的hUC-MSCs，通過感染攜帶綠色熒光蛋白(green fluorescent protein，GFP)的亂序腺病毒(由課題組前期包裝重組腺病毒獲得)，PBS洗2次，按濃度為1×10pfu/L的病毒液，每個培養皿中加入100 μl，37 ℃孵育1.5～2 h后PBS液洗凈，加入含10%FBS+L-DMEM液繼續培養48 h，活細胞工作站觀察GFP的表達。如GFP表達率達70%左右,消化、離心、PBS液洗滌后，制備成細胞密度為1×10個/L的細胞懸液，用微量注射器l ml注射器吸取細胞懸液置于冰上待移植用。

于缺氧缺血腦損傷后1 d采用側腦室穿刺方法進行細胞移植。移植部位為左側(損傷側)側腦室，注射位點：冠狀縫后1.5 mm，顱骨矢狀縫左1.5 mm，顱骨下-3 mm。使用微量注射器均勻緩慢注射hUC-MSCs 細胞懸液5 μl，停針5 min，然后緩慢退出，縫合消毒。待新生鼠蘇醒后繼續置于原母鼠籠中喂養。

1

.

2

.

3

檢測hUC

-

MSCs在HIE大鼠大腦內的定植及TTC染色觀察梗死腦組織 各組大鼠hUC-MSCs移植治療48 h后，乙醚深度麻醉處死后經心腔內灌注PBS。取部分大腦組織，冰凍切片成8 μm厚度，熒光顯微鏡下觀察切片中綠色熒光陽性細胞在大鼠大腦內定植分布情況，追蹤移植細胞的定位、數量。另取部分大腦組織切成2 mm厚的切片，浸泡在37℃、2%TTC溶液中5 min，然后用10%甲醛溶液固定。用Image J軟件追蹤和分析梗死體積。其余大腦組織置于液氮備用。

1

.

2

.

4

RT-qPCR法測定海馬組織中Beclin-2、Caspase-3 mRNA 水平的變化 根據RT-qPCR試劑盒說明書，液氮中取出大腦組織，稱取50 mg，PBS清洗后加1 ml Buffer Rlysis A，室溫裂解5 min，轉移至玻璃研磨器中，充分研磨。加0.2 ml氯仿，12 000 r/min離心15 min。取500 μl上清液加入1/3體積無水乙醇混勻，12 000 r/min離心10 min。棄上清液再加入預冷的無RNase 75%乙醇，12 000 r/min離心10 min。再次棄上清液，干燥后加入無RNase水50 μl，-80℃凍存備用。根據生工M-MuLV合成試劑盒說明書操作，建立20 μl PCR反應體系(各基因RT-qPCR引物序列見表1)。

表1 各基因RT-qPCR引物一覽表

1

.

2

.

5

Western blot檢測海馬組織中Beclin-2、Caspase-3蛋白的表達 按照生工生物工程上海股份有限公司提供的全蛋白提取試劑盒說明書，將海馬固體組織置于培養皿中，剪碎成3 mm×3 mm左右的小塊， PBS液洗滌2次，離心取沉淀，4℃玻璃勻漿器勻漿 20次。取組織勻漿液劇烈震蕩2～3次，3 000 r/min、4℃離心10 min，取上清液即全蛋白提取物，用BCA試劑盒檢測所提蛋白的濃度。后續蛋白提取實驗參照說明書進行。

2 結果

2.1 hUC-MSCs培養、擴增及鑒定結果

接種1周可見細胞從組織塊中爬出，貼壁生長。接種14 d細胞融合至50%左右。去除組織塊并換液后，細胞生長迅速，再培養3～5 d，細胞融合可達80%以上。傳代后生長更加迅速，細胞呈長梭形或多角形、旋渦狀或流水樣分布。1傳2，3～5 d可融合至70%～80%，傳下一代。利用機械法可從臍帶華爾通膠獲得貼壁生長的hUC-MSCs，并經培養、傳代，可純化、擴增得到大量滿足實驗需要的hUC-MSCs(圖1)。課題組前期用同樣方法培養出CD44 、CD73 、CD90陽性表達的細胞，而 NOT-hUC-MSCs呈陰性，符合 MSCs 的生物學特征。

圖1 第三代hUC-MSCs ×200

2.2 hUC-MSCs的熒光標記

上述hUC-MSCs通過感染重組攜帶GFP的腺病毒48 h后，在熒光顯微鏡下可觀察到超過70%的細胞GFP呈陽性表達(圖2)，可以用于后續實驗示蹤。

2.3 hUC-MSCs在HIE大鼠大腦內的定植及TTC染色觀察梗死腦組織情況

治療組大鼠hUC-MSCs移植治療48 h后，大腦組織冰凍切片在熒光顯微鏡下顯示移植側(左側)側腦室周圍散在分布的發綠色熒光的hUC-MSCs，提示hUC-MSCs遷移并定植于腦組織中(圖3)。TTC染色實驗結果表明，對照組大腦沒有形成梗死體積；模型組大鼠大腦梗死體積明顯，其梗死體積比為(41.67±4.17)%；治療組大腦經hUC-MSCs移植治療48 h后，梗死體積減小，梗死體積比為(16.65±3.43)%，與模型組比較，差異有統計學意義(圖4，白色為梗死灶)，表明hUC-MSCs可減小缺氧缺血損傷大鼠大腦梗死體積，對損傷大鼠具有保護作用(圖4)。

2.4 大鼠海馬組織中Beclin-2、Caspase-3的變化

HIE建模后48 h，內源性Beclin-2 、Caspase-3 的mRNA以及蛋白的表達明顯上調(圖5 A)。hUC-MSCs移植治療48 h后， Beclin-2、caspase-3 的mRNA以及蛋白的表達下降(圖5B、C)。

3 討論

hUC-MSCs來源豐富，采集方便，通過機械法分離、培養、擴增技術成熟，經流式細胞術鑒定，為實驗用目的細胞，可大量制備。hUC-MSCs對產婦和新生兒不會帶來任何創傷和不良反應，且較其他來源的MSCs更原始，增殖能力強，長期傳代不易分化，不會有腫瘤細胞，被病原微生物感染幾率低，亦不涉及倫理爭議，是再生醫學領域理想的種子細胞。hUC-MSCs獨特的生物學特征，特別是其跨胚層的分化潛能，展現出誘人的應用前景，成為再生醫學與轉化醫學研究的熱點。本研究結果顯示，將體外培養的hUC-MSCs 通過側腦室植入HIE新生大鼠實驗，利用熒光示蹤、TTC染色、海馬細胞Beclin-2、caspase-3 的mRNA和蛋白檢測，顯示hUC-MSCs移植后，能向腦室周圍組織間隙遷移，定植于HIE大鼠大腦病灶部位，并有效地減小了缺氧缺血損傷大鼠大腦梗死體積，減輕缺氧缺血損傷所致的大鼠神經元病變，對損傷大鼠大腦具有保護作用。同時，hUC-MSCs能夠明顯減少大鼠腦細胞凋亡，顯著下調缺氧缺血腦損傷大鼠海馬區細胞凋亡相關Beclin-2與Caspase-3的mRNA以及蛋白水平。

圖2 hUC-MSCs熒光表達 ×200

圖3 hUC-MSCs在HIE大鼠大腦內的定植 ×50

圖4 各組大鼠大腦TTC染色與對照組比較：*P<0.05 ；與模型組比較：#P<0.05

圖5 Beclin-2和Caspase-3的mRNA以及蛋白的表達情況A： mRNA；B：蛋白；與模型組比較： *P<0.05

近年來，有研究報道細胞凋亡與Beclin-2和Caspase-3關系密切。Beclin-2通過與Ⅲ類PI3K復合物和Bcl-2相互作用調節細胞凋亡和自噬。Beclin-2在作為融合調節因子的同時，還可以增強溶酶體的轉運和代謝多樣性，增強Beclin家族在細胞凋亡及自噬中的作用，以及在受損組織中的表達。作為Caspase級聯下游最關鍵的凋亡執行者，Caspase-3在疾病的發生發展中起著重要作用。Caspase-3參與多種神經細胞的凋亡過程，可被一系列因子激活。凋亡過程中，Caspase-9首先被激活，進而切割和激活Caspase-3，裂解其蛋白底物，最終導致凋亡的發生。本實驗中，Beclin-2和Caspase-3在HIE模型建立后48 h內均有高表達。經hUC-MSCs處理后，Beclin-2和Caspase-3的表達均降低。提示hUC-MSCs在HIE新生大鼠腦損傷修復中起調節作用，調節凋亡相關蛋白Beclin-2和Caspase-3，抑制HIE大鼠腦細胞凋亡。hUC-MSCs移植可促進HIE大鼠神經功能恢復，縮小梗死體積和缺氧缺血性損傷，抑制神經元凋亡。另外， hUC-MSCs定植后通過分泌多種因子，抑制炎癥反應和宿主神經細胞凋亡，并促進血管和軸突再生。hUC-MSCs可通過自身分化、轉分化以及旁分泌功能發揮再生修復以及神經保護作用。其療效穩定，且無明顯不良反應。hUC-MSCs作為一類免疫缺陷細胞，異體移植無免疫排斥反應或反應較弱，不需嚴格配型，適宜于不同個體之間的移植。hUC-MSCs 治療HIE 安全有效，并具有一定的優勢，為未來臨床進一步擴大應用提供依據。相信隨著對hUC-MSCs研究的不斷深入，其必將廣泛應用于臨床HIE的治療以及其他疾病或亞健康、抗衰老等領域，為人類健康和生活質量的提高發揮巨大作用。