CXCL5、MMP-9在宮腔粘連子宮內膜組織表達及其臨床意義

李從青，王文艷，許有江，方子昂，孫士瑩，衛 兵

宮腔粘連(intrauterine adhesion, IUA)是指子宮內膜基底層遭到破壞后子宮壁之間的粘連，主要發生于人工流產后，涉及炎癥趨化因子招募、炎癥反應及子宮內膜細胞外基質降解等過程。CXC細胞趨化因子配體-5(CXC cell chemokine ligand-5,CXCL5)是有強烈炎癥趨化作用的因子之一，基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)與細胞外基質降解相關，其中MMP-9尤為突出，目前關于CXCL5及MMP-9與IUA關系的研究很少。該研究統計了IUA在宮腔粘連分離手術(transcervical resection of adhesions，TCRA)后宮腔形態恢復情況，旨在探討CXCL5和MMP-9表達與IUA的臨床意義。

1 材料與方法

1.1 病例資料

收集安徽醫科大學第二附屬醫院婦產科在2018年1月—2019年10月間收治因IUA行TCRA治療的患者48例，術中記錄IUA程度及評分，評級及評分標準：歐洲婦科內鏡協會(European society for gynecologic endoscopy，ESGE)分類標準、中華醫學會婦產科學分會宮腔粘連臨床診療中國專家共識評分標準?；颊咴赥CRA術后1個月行宮腔鏡二次探查。48例IUA患者，年齡24～40(29.5±3.2)歲。IUA患者ESGE分度：Ⅳ度36例，Ⅴa度7例，Ⅴb度5例。IUA評分為(23.2±2.4)分。收集同期因“排除內膜病變”行宮腔鏡檢查的患者48例為對照組。對照組年齡21～39(24.75±4.3)歲。本實驗研究經醫院倫理委員會批準[倫理文件批號：PJ-YX2019-016(F1)]。

1.2 實驗材料與儀器

免疫組化試劑盒購自武漢賽維爾生物科技有限公司；RIPA裂解液購自上海碧云天公司；苯甲基磺酰氟購自美國Sigma公司；ECL顯色劑購自美國Thermo公司；Western blot試劑盒購自上海碧云天公司；PVDF膜購自美國Millipore公司；TRIzol購自美國賽默飛公司。CXCL5、MMP-9、GADPH 引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。主要設備：4 ℃離心機(HICATHI CS150NX,日本)，顯影儀(Tanon4600，上海)，核酸蛋白濃度測定儀(IMPLEN， 江蘇)，PCR儀(FlexCycler，德國)。

1.3 子宮內膜標本的收集

研究對象在手術前簽署知情同意書，完善術前檢查(血液常規、凝血功能、肝腎功能、免疫系列、心電圖、白帶常規等檢查)和排除手術禁忌，選擇月經干凈后3 d行宮腔鏡手術治療(對于閉經患者，無明確時間要求)。宮腔鏡設備：STORZ(德國)高清宮腔鏡全套設備，選擇5%甘露醇作為膨宮介質，膨宮壓力設定為13.4 kPa，膨宮液體流速設置為250 ml/min，手術操作時選擇單極電切設備(針狀電極和90°電切環)，功率為70 W，獲取IUA組子宮內膜組織，患者在宮腔粘連術后一個月行宮腔鏡二次探查手術，再次獲取少許子宮內膜組織。對照組在宮腔鏡檢查時獲取子宮內膜組織。將所獲取子宮內膜組織分為2份，一份福爾馬林固定，后續免疫組化使用；另一份置于-80 ℃冰箱用于蛋白及mRNA測定。

1.4 方法

1

.

4

.

1

免疫組織化學方法檢測CXCL5和MMP-9的表達 將組織標本石蠟包埋后，進行切片、染色、制片等一系列處理。切片置于67 ℃烘箱中2 h，脫蠟至水，用pH 7.4的PBS洗滌3次，去離子水孵育30 min后PBS沖洗，每切片加1滴10%山羊血清，在室溫下保持30 min，滴加稀釋處理后的一抗，4 ℃過夜后，逐滴加入生物素標記的第二抗體，室溫下孵育1 h；PBS再次洗滌，加入1滴鏈霉抗生物素蛋白-過氧化物酶，室溫下孵育20 min。PBS沖洗后加入1滴酶標的抗鼠/兔聚合物，室溫下30 min，DAB顯色后在顯微鏡下觀察。當顯微鏡下顯示出棕黃色時，用蒸餾水洗滌組織切片后復染細胞核，蒸餾水洗滌后用蘇木精返藍染色溶液返藍處理，脫水封片后直接在顯微鏡下觀察免疫組化的效果并分析。使用Image-pro plus 6.0免疫組化分析軟件進行結果分析，每張切片至少選擇3個200倍視野進行拍照，遵循隨機挑選原則。

1

.

4

.

2

Western blot檢測CXCL5和MMP-9蛋白表達 取100 mg子宮組織標本，加入500 μl RIPA裂解液、5 μl苯甲基磺酰氟，放入4 ℃離心機 13 200 r/min，離心30 min后，吸取上清液。按照上樣緩沖液(5×buffer) ∶蛋白=1 ∶4比例上樣，水浴鍋中煮蛋白后測定蛋白含量，按照Western blot試劑盒要求配樣，電泳和轉膜處理，抗體封閉后再進行ECL顯色，顯影儀上微調圖像，image J軟件分析Western blot灰度值，得出相對表達數據。

1

.

4

.

3

RT-PCR檢測CXCL5和MMP-9 mRNA表達 取80 mg子宮內膜組織標本，加入800 μl TRIzol進行充分研磨，加氯仿160 μl，震蕩混勻后冰浴10 min，低溫離心機離心20 min，收集上層水相400 μl，加400 μl異丙醇，搖勻混勻，置于-20 ℃冰箱中助沉60 min，再次低溫離心20 min。去除上清液后，加1 ml 75%乙醇，冰上靜置10 min，低溫離心10 min，棄上清液，待乙醇充分揮發干燥，加入無酶水20 μl，用槍頭吹打溶解。立即測定RNA濃度。PCR儀上設定逆轉錄條件：37 ℃、15 min， 85 ℃、5 s。使用RT-PCR擴增，循環參數設置如下：95 ℃預變性5 min，95 ℃變性10 s，60 ℃復性40 s，72 ℃延伸90 s，共循環45 次；最后72 ℃延伸5 min。引物序列：CXCL5上游5′-CTATCAACTGCCCTTCCACAAT-3′，下游5′-TCTCTATCTGCCCACAGCCTAC-3′；MMP-9上游5′-TTGACAGCGACAAGAAGTGG-3′，下游5′-CCC TCAGTGAAGCGGTACAT-3′；GADPH上游5′-GGTTG AGCAGGTACTTT-3′，下游5′-AGCAAGAGCACAAG AGGAAG-3′。使用2計算mRNA相對GAPDH的表達量。

2 結果

2.1 IUA TCRA后宮腔形態評估TCRA術后再次評估宮腔情況

經TCRA手術治療，47例患者宮腔形態改善明顯，1例粘連程度仍然較重。按照ESGE分度：Ⅰ度40例，Ⅱ度5例，Ⅲ度2例，Ⅳ度1例。Ⅰ～Ⅲ度在宮腔鏡檢查過程中使用鏡鞘進行分離，Ⅳ度患者行再次TCRA手術治療。

2.2 CXCL5、MMP-9蛋白在3組中表達情況

免疫組化結果顯示：CXCL5和MMP-9蛋白主要表達在子宮內膜細胞膜上，對照組的陽性率最高，IUA術后組次之，IUA組最低，見圖1A。其差異有統計學意義(

F

=71.50、35.25,

P

<0.05)。見圖1B。Western blot結果提示CXCL5和MMP-9蛋白在3組子宮內膜中均有表達，在IUA組表達最低，IUA術后組稍高。IUA組及IUA術后組表達量均低于對照組，其相對灰度值之間的差異有統計學意義(

F

=22.66、25.61，

P

<0.05)。見圖2。

2.3 CXCL5和MMP-9 mRNA在3組子宮內膜中的表達

RT-PCR結果顯示：CXCL5和MMP-9 mRNA在3組子宮內膜中均有表達，表達水平從高至低分別為對照組、IUA術后組、IUA組，差異有統計學意義(

F

=12.21、43.36，

P

<0.05)。3組子宮內膜組織的CXCL5和MMP-9 mRNA的結果與免疫組化、Western blot 蛋白表達結果一致。見圖3。

2.4 CXCL5與MMP-9在子宮內膜組織中表達的相關性分析

使用Pearson相關性檢驗對CXCL5和MMP-9檢測結果進行相關性分析，分析結果顯示CXCL5與MMP-9在人子宮內膜組織中的表達有明顯相關。見表1。

表1 IUA患者及對照組子宮內膜組織CXCL5及MMP-9的相關性分析

3 討論

IUA是子宮內膜基底層受損后炎癥因子廣泛參與，內膜修復過程出現異常調節最終纖維化的過程。炎癥反應是IUA一個重要過程，Wang et al從炎癥因子代表性之一的核轉錄因子-κB(Nuclear transcription factor-B，NF-κB)去研究IUA發病機制，納入了40例IUA患者和20例正常對照組患者，檢測子宮內膜組織的NF-κB mRNA表達情況，結果顯示NF-κB在IUA患者子宮內膜組織中明顯增高。在IUA初期，炎性趨化因子連同炎癥因子大量聚集，參與子宮內膜纖維化的形成。炎癥因子是受炎性趨化因子招募后聚集在組織之中，CXCL5具有強烈炎性因子趨化作用，研究者從絲裂霉素通路、內毒素-toll受體通路及Pi3k/akt通路等關于炎癥基礎研究中探索CXCL5和NF-κB之間的關系，既往研究顯示IUA子宮內膜中NF-κB過表達，CXCL5在IUA子宮內膜的中表達情況未見大量報道。本實驗以炎癥因子上游的趨化因子為切入點，結果顯示CXCL5在IUA組子宮內膜呈低表達狀態，并非高表達狀態，出現這種結果推測與下列因素有關：炎癥反應在疾病發展初期比較強烈，炎癥趨化因子及炎癥因子會升高，隨著疾病的進展或接近疾病終末而逐漸下降，本研究中納入的病例資料均為臨床證實的IUA，早已不在疾病的初始階段。此外，本研究通過對比顯示宮腔粘連手術后患者子宮內膜中CXCL5表達量增加。有研究表明，子宮內膜周期性再生過程中，細胞因子和趨化因子是子宮內局部環境的重要調節因子，在月經期間或月經后不久，子宮內膜組織中含有大量的CXC趨化因子及炎癥因子，從月經期就開始并廣泛參與了子宮內膜細胞的激活，一直維持月經干凈后的一段時間。本研究對照組宮腔鏡檢查獲取子宮內膜的時間處于月經干凈后3 d，此時子宮內膜的炎癥趨化因子及炎癥因子仍可維持一定水平，這也許是本研究檢測IUA患者子宮內膜的CXCL5表達水平比對照組低的原因。

圖1 CXCL5、MMP-9蛋白在3組中表達情況 ×400

圖2 Western blot檢測CXCL5和MMP-9在3組中表達情況與對照組比較：*P<0.05；與IUA組比較：#P<0.05

圖3 RT-PCR檢測CXCL5和MMP-9 mRNA在3組中表達情況與對照組比較：*P<0.05；與IUA組比較：#P<0.05

在機體內，MMP參與了多種促炎趨化因子的裂解，從而調節其功能并對炎癥過程產生影響，CXCL5和MMP-9位于Pi3k/akt通路的上下游位置，兩者關系密切。Song et al在腹膜炎的研究中發現，體內MMP-9積極參與CXCL5炎癥因子趨化過程，促進中性粒細胞廣泛招募。Gao et al發現CXCL5/CXCR2軸通過激活Pi3K/akt誘導MMP2/MMP9上調，可以促進膀胱癌細胞遷移和侵襲。研究發現MMP-9參與了肝臟、肺臟、腎臟等器官組織纖維化，MMP-9過度表達能改善疾病的纖維化。子宮內膜組織纖維化是IUA的重要過程之一，目前尚無MMP-9和IUA子宮內膜纖維化的相關研究發表，在本研究中，IUA組子宮內膜組織中的MMP-9呈低表達狀態，IUA組子宮內膜組織中的MMP-9呈低表達狀態，導致細胞外基質降解減少，從而產生宮腔粘連。當TCRA后子宮內膜的生長恢復，伴隨著子宮內膜組織MMP-9的含量增加，從而改善宮腔粘連，對比IUA術后子宮內膜中MMP-9表達量增加，也進一步提示MMP-9參與子宮內膜的細胞外基質降解，MMP-9與子宮內膜生長也許是一種互為因果的關系。結合本研究結果，推測MMP-9參與了子宮內膜組織纖維化和IUA的發生。

子宮內膜組織有其特殊性，會隨著雌孕激素的周期性變化產生規律性脫落，正常子宮內膜脫落后修復過程中并未產生宮腔粘連，而損傷后的內膜卻產生了粘連，其中子宮內膜細胞基質降解過程的調節和平衡至關重要。本研究顯示對照組子宮內膜中的CXCL5和MMP-9均呈高表達狀態，高表達MMP-9使受損子宮內膜細胞外基質的降解加強，從而避免了子宮內膜纖維化和IUA的產生。本研究將CXCL5和MMP-9聯系一起，并進行相關性分析，無論是IUA組，還是IUA術后組以及對照組，結果均顯示兩者表達明顯相關，CXCL5與MMP-9表達趨勢一致，均參與了IUA。在流產或刮宮操作后，提高子宮內膜MMP-9水平或許可以預防IUA發生，或者預防TCRA后子宮內膜再粘連。

綜上所述，重度IUA治療棘手，嚴重影響女性生育力，研究IUA發生機制尤為迫切，本研究綜合考慮了子宮內膜炎癥和細胞外基質降解兩個重要過程，初步探索了CXCL5和MMP-9的表達情況。在后續的研究中，進一步擴大樣本量，拓寬CXC及MMP家族其他成員的表達情況，深入研究IUA的子宮內膜纖維化機制，為IUA治療提供新思路。