血管緊張素Ⅱ 2型受體基因敲除小鼠的構建、繁育和基因型鑒定

蔣 吉，胡姍姍，魏 偉

Agtr2作為G蛋白偶聯受體(G-protein coupled receptors, GPCRs)，一般在胚胎時期表達較多，出生后表達水平大幅降低，但在病理狀態，如炎癥、損傷等情況下，其表達水平較正常生理狀態顯著增高。有文獻報道，直接激動Agtr2導致了血管內皮的舒張，抑制炎癥反應以及促進神經元的修復再生。課題組既往研究顯示，Agtr2在佐劑性關節炎(adjuvant induces arthritis，AIA)大鼠滑膜組織中的表達升高可在氯沙坦治療后進一步上調，且上調水平與炎癥指數的減輕呈正相關，提示Agtr2可能具有緩解類風濕關節炎(rheumatoid arthritis，RA)炎癥免疫反應的作用。在此基礎上，該研究構建了Agtr2基因工程小鼠，并對Agtr2小鼠進行擴繁、基因型鑒定和蛋白檢測，將為進一步研究Agtr2在疾病發病機制中的作用以及作為藥物的作用靶點提供重要實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

55只7周齡C57BL/6J鼠，30只雄鼠、25只雌鼠，體質量為(20±2) g，購自江蘇集萃藥康生物科技有限公司，生產許可證號：SCXK (蘇) 2015-0001。所有實驗均經安徽醫科大學臨床藥理研究所動物實驗倫理委員會批準，并于SPF級實驗室飼養繁育小鼠。

1.2 主要試劑

核酸染料購自北京康潤生物科技有限公司；瓊脂糖凝膠購自法國Biowest公司；Genotyping Mix購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司；Proteinase K購自美國Sigma Aldrich公司；異丙醇購自國藥集團化學試劑有限公司；RIPA蛋白裂解液、苯甲基磺酰氯、5×電泳加樣緩沖液購自江蘇碧云天生物技術公司；抗GAHDH抗體購自美國Affinity Biosciences公司；抗Agtr2抗體購自英國Abcam公司；辣根酶標記的山羊抗兔IgG購自北京中杉金橋生物公司；ECL化學發光試劑盒購自上海天能科技有限公司。

1.3 主要儀器

通用型電泳儀DYY-7C型購自北京六一生物科技有限公司；熒光定量PCR儀購自上海伯樂生命醫學產品有限公司；Tanon-1600全自動數碼凝膠圖像分析系統購自上海天能科技有限公司；LAS4000Mini型化學發光成像分析儀購自美國GE公司。

1.4 方法

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Cas9/先導RNA(single guide RNA, sgRNA)載體構建 小鼠Agtr2由363個氨基酸組成，分子量為41.2 ku，Agtr2基因包括3個外顯子和2個內含子，基因ID為11609，基因定位在Xq22-23。利用美國麻省理工學院CRISPR Design軟件(http://crispr.mit.edu)，按照sgRNA設計原則，選擇外顯子3作為設計靶位點，經過設計篩選后得到兩對sgRNA，分別為：Agtr2-S1(GTGCATATTAGGATAGAGTC)、Agtr2-S2 (GCATTTCTCTATGAAGCAGC)、Agtr2-S3(TGTATTATGACACTACGTAA)、Agtr2-S4(CTCATGCTATATCATATGGT)。將設計的sgRNA寡核苷酸單鏈利用PCR儀退火形成雙鏈。將雙鏈sgRNA與線性化載體PGK1.1 linear vector在T4 DNA連接酶作用下16℃過夜連接，連接產物轉染到DH5α感受態細胞，通過PCR和基因測序挑選陽性克隆產物，完成sgRNA載體構建。

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Agtr2小鼠的獲得 將體外轉錄的sgRNA與Cas9混合后，顯微注射到C57BL/6J鼠受精卵中，Cas9蛋白在sgRNA引導下結合到靶位點進而造成DNA雙鏈斷裂，從而實現靶位點堿基序列缺失，最終實現基因敲除(圖1)。將受精卵移植進C57BL/6J 雌性小鼠體內，繁育得到F0代小鼠。

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Agtr2小鼠的飼養和繁育 Agtr2小鼠于SPF級動物實驗室內飼養和繁殖。嚴格控制溫度(18 ～ 22℃)、濕度(0.4 ～ 0.7)等飼養條件，晝夜明暗交替時間12/12 h，所有小鼠飼養所需物品如籠盒、飼料等均經過高溫高壓消毒滅菌，每日定時定量喂食滅菌核桃仁保證小鼠營養供給。飼養期間，每天補充飼料、更換飲用水、觀察記錄小鼠體質量等生長狀況，每3 d更換1次小鼠墊料。各種操作均在超凈工作臺內按無菌操作進行。繁殖出F0代敲基因鼠后，與同窩野生型C57BL/6J小鼠進行合籠，以得到更多F1代小鼠進行檢測。孕鼠妊娠期21 d左右，子鼠19 ～ 21 d可與母鼠分籠，將雌、雄小鼠分籠飼養，雄鼠8周、雌鼠6周左右性成熟，可用于配繁。

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基因型鑒定

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鼠尾DNA提取 待F0代子鼠2周齡時，剪取小鼠尾尖部(長不超過0.3 cm)，放入1.5 ml EP管中，加入490 μl鼠尾裂解液(100 ml裂解液中含5 ml質量分數為0.1的SDS、2 ml 5 mol/L NaCl、1 ml 1mol/L Tris·Hcl、10 ml 0.5 mol/L EDTA、82 ml HO)和10 μl Proteinase K(10 mg/ml)，混勻后將含有鼠尾的EP管放入60℃金屬浴中消化過夜。第二天，將EP管放入100℃金屬浴中煮沸10 min終止裂解。樣本于高速離心機10 000 r/min離心10 min后，取上清液轉移至新EP管中，加入2倍上清液體積的無水乙醇，上下顛倒混勻，可以看到白色絲狀的DNA析出，以 12 000 r/min 離心10 min，棄上清液，加800 μl體積分數為0.75的乙醇后，以12 000 r/min離心5 min，棄上清液，小心吸棄殘留乙醇，晾干(大約30 min)，加入100 μl TE溶液溶解DNA，進行PCR檢測。

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PCR擴增反應 實驗所用引物均由上海生工生物工程有限公司合成。引物序列見表1。

表1 Agtr2-/-小鼠基因鑒定PCR反應引物序列

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瓊脂糖凝膠電泳 1×TAE buffer 30 ml，加入瓊脂糖0.3 g及1 μl的核酸染料，取上述PCR擴增產物10 μl，電壓120 V，電泳30 min，于Tanon-1600全自動數碼凝膠圖像分析系統中拍照觀察。

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小鼠主要器官Agtr2蛋白水平檢測 待F1代小鼠8周時，禁食過夜，同時取同窩野生型及Agtr2純合子小鼠心臟、肝臟、脾臟、胸腺以及腎臟組織勻漿提取組織蛋白，進行標準蛋白定量。加入5×loading buffer煮10 min后，采用質量分數為0.1的SDS-PAGE電泳，后轉移至PVDF膜，質量分數為0.05的脫脂奶粉室溫封閉2 h，TPBS洗3次，PBS洗1次，每次10 min，后加入Agtr2一抗(1 ∶2 000)，4 ℃孵育過夜，次日用TPBS洗3次，每次10 min，加入對應山羊抗兔IgG(1 ∶10 000)，室溫孵育2 h后繼續用TPBS洗3次，PBS洗1次，每次10 min。使用LAS4000Mini型化學發光成像分析儀，利用ECL發光液進行蛋白質信號檢測。Image J軟件分析目的條帶灰度值。

圖1 利用CRISPR/Cas9系統敲除Agtr2基因策略

2 結果

2.1 獲得Agtr2

F0代小鼠

將sgRNA與Cas9的混合物顯微注射入C57BL/6J小鼠受精卵中，獲得18只F0代小鼠，編號為1～18，提取尾部DNA分別與WT引物和KO引物進行PCR擴增反應，后通過瓊脂糖凝膠電泳分析目的條帶。野生型：PCR反應未獲得1 123 bp條帶，可以獲得403 bp條帶；雜合子：PCR反應可以獲得1 123 bp條帶，也可以獲得403 bp條帶；純合子：PCR反應可以獲得1 123 bp條帶，未獲得403 bp條帶。鑒定結果見圖2。由圖可知，純合子：2～8、11～18；雜合子：1、9、10；未獲得野生型小鼠。

圖2 F0代Agtr2-/- 小鼠PCR結果

2.2 獲得Agtr2

F1代小鼠

為構建穩定遺傳的Agtr2小鼠，將F0代雄鼠與不同母本的雌鼠按1∶2進行合籠，共得到55只F1代小鼠，編號為19～73。每只子鼠的DNA分別與WT引物和KO引物進行PCR擴增反應，后通過瓊脂糖凝膠電泳分析目的條帶，結果見圖3。由圖可知，純合子：27、30、32、33、53、70 ～ 73；雜合子：19、21 ～ 23、34 ～ 38、44、45、47、56 ～ 58、60 ～ 69；野生型：20、24 ～ 26、28、29、31、39 ～ 43、46、48 ～ 52、54、55、59。至此成功獲得遺傳穩定的Agtr2小鼠。

圖3 F1代Agtr2-/- 小鼠PCR結果

2.3 Agtr2

小鼠的繁殖情況

將sgRNA與Cas9的混合物顯微注射入C57BL/6小鼠受精卵中，母鼠成功繁殖出F0代Agtr2幼鼠，將F0代小鼠與同窩野生型C57BL/6J小鼠進行交配，成功繁殖出更多的F1代Agtr2小鼠。孕鼠妊娠期集中在19 ～ 21 d左右，每胎可產5 ～ 8只幼鼠，成活率超過九成。Agtr2小鼠各項體征較野生型小鼠無明顯差異。

2.4 Agtr2

小鼠主要臟器內Agtr2蛋白表達情況

Western blot檢測PCR鑒定后Agtr2基因敲除純合子小鼠以及野生型小鼠Agtr2蛋白表達情況，共檢測了心臟、肝臟、腎臟、脾臟和胸腺5種臟器，結

圖4 F2代Agtr2基因敲除純合子小鼠與野生型小鼠Agtr2蛋白表達

3 討論

近年來，對Agtr2的研究已經不僅僅局限于心血管系統，其在自身免疫性疾病中的作用也愈發得到重視。ERK1/2-NF-κB信號轉導失衡是RA發病過程中單核/巨噬細胞異常活化的關鍵，產生大量促炎細胞因子。使用C21活化Agtr2及其下游信號可直接抑制ERK1/2-NF-κB信號的過度活化，調節單核/巨噬細胞的穩定，促進巨噬細胞抗炎細胞因子IL-10的分泌，抑制促炎細胞因子如TNF-α和IL-6的產生，緩解炎癥。注射Agtr2特異性激動劑CGP42112可通過減少關節滑膜巨噬細胞、T淋巴細胞等炎性細胞浸潤，抑制滑膜細胞過度增殖，有效減輕AIA大鼠的疾病表現。C21通過抑制腎臟氧化應激、炎癥和纖維化，抑制實驗性糖尿病腎病的進展，而使用Agtr2阻斷劑PD123319則會損害C57BL/6J小鼠的胰島素信號轉導。在炎性腸病中，Agtr2的激活刺激黏膜中一氧化氮的形成，參與調節胃腸道上皮屏障的形成，對炎性腸病的有明顯的治療作用。

動物模型是醫學實驗的基礎，為了更好地探究Agtr2的功能，本研究構建了Agtr2基因敲除小鼠，并采用操作簡便，重復性、適用性更好的PCR-瓊脂糖凝膠電泳的方法，對所得Agtr2基因敲除小鼠進行基因型鑒定，可靠驗證了模型的遺傳穩定性。Agtr2在不同組織內的表達水平不同，轉錄和翻譯水平也可能存在一定差異，但Western blot結果顯示，Agtr2 基因敲除純合子小鼠主要臟器內幾乎不表達Agtr2蛋白，進一步驗證了模型的可靠性。雖然純合子Agtr2小鼠的Western blot結果條帶中也存在微弱的Agtr2蛋白表達，這可能與Agtr2抗體特異性相對較低有關。Agtr2基因敲除小鼠的建立將為進一步研究Agtr2在疾病發病機制中的作用以及作為藥物的作用靶點提供重要實驗基礎。