沉默環狀RNA PIP5K1A通過抑制Wnt/β-catenin信號通路來降低口腔鱗癌細胞生長與轉移

王天雪，孫 強，李 佳

口腔鱗狀細胞癌(oral squamous cell carcinoma，OSCC)是占90%以上比例的口腔癌的病理亞型，是第六位常見的惡性腫瘤。近些年，盡管在OSCC治療(包括手術、化療和放射治療)和分子機制研究方面均取得了重要進展，但OSCC具體的發病和進展機制至今仍不完全明晰，OSCC的復發和轉移率很高，患者5 年生存率相對較差。對影響OSCC進展的關鍵分子靶點的鑒定和篩選將為制定OSCC診斷和治療的新策略提供參考依據。

環狀RNAs(circular RNAs，circRNAs)是通過將3’端連接到RNA的5’端而形成圓環結構的一類獨特的內源性非編碼RNA，不僅具有高度穩定的生物學特點，還在調節腫瘤細胞增殖、凋亡和自噬等多種病理生理過程中發揮著重要作用。環狀RNA PIP5K1A(circRNA PIP5K1A，circPIP5K1A)已被發現在胃癌、非小細胞肺癌、結腸癌和卵巢癌中上調表達并發揮促癌作用，而其在OSCC中的表達和作用并不清楚，該研究觀察circPIP5K1A在OSCC組織和細胞系中的表達與作用，并分析其可能的機制。

1 材料與方法

1.1 材料

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主要試劑與儀器 胎牛血清、DMEM培養基、Lipofectamine 3000和TRIzol試劑(美國Invitrogen公司)；RNase R試劑(美國Epicentre公司)；CCK-8試劑盒、Annexin V-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒、cDNA第一鏈合成(M-MLV)試劑盒和RT-qPCR檢測試劑盒(南京凱基生物公司)；抗β-catenin和Wnt1抗體(美國Santa Cruz公司)；抗GAPDH抗體和HRP標記的二抗(上海碧云天生物公司)。LightCycler 480實時熒光定時PCR系統(瑞士Roche公司)；318C+ 酶標儀(上海沛歐分析儀器有限公司)；BX53MRF-S顯微鏡(日本Olympus 公司)；FACSCanto II流式細胞儀(美國BD公司)；蛋白垂直電泳電轉系統(美國Bio-Rad公司)。

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臨床樣本獲取 樣本來源于鄭州大學第一附屬醫院口腔頜面外科行腫瘤切除術的20例T1-T3期OSCC患者，并收集癌組織和癌旁組織樣本。所有患者均首次確診，未進行過放化療，且所有患者對本研究均知情同意，本研究經倫理委員會批準。

1.2 方法

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細胞培養 口腔角質細胞(human oral keratinocytes，HOK)以及OSCC細胞株SCC15和CAL27購自美國ATCC。細胞接種在添加10%胎牛血清、100 U/ml 青霉素和100 μg/ml鏈霉素的DMEM培養基中，并置于37℃、5%CO培養箱中培養。

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轉染 circPIP5K1A的2種小干擾RNA[siR#1(5′-UUCUUCUAAGGGAUUGGAGUU-3′)和siR#2(5′-UAAGGGAUUGGAGUUGGUCUU-3′)]以及陰性對照si-NC(5′-AAUUCUCCGAACGUGUCACGU-3′)由上海吉瑪基因公司合成。根據說明書步驟，用Lipofectamine 3000將siR#1、siR#2和si-NC分別轉染至SCC15和CAL27細胞。48 h后，收集細胞，用RT-qPCR檢測轉染效率，并篩選最有效的siR作為候選si-circPIP5K1A用于后續實驗。

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RNase R處理與RT

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qPCR 用TRIzol試劑從OSCC組織、癌旁組織以及細胞中提取總RNA。取OSCC組織來源的RNA，在37℃條件下，用或不用2 U/μg 劑量的RNase R處理15 min，用于鑒定circPIP5K1A環形結構。分別取上述所有樣本的RNA通過cDNA第一鏈合成(M-MLV)試劑盒逆轉為cDNA。然后根據說明書，將cDNA、目的基因的引物以及Maxima SYBR Green qPCR Master Mix試劑在實時PCR系統上進行RT-qPCR反應。所用的引物：circPIP5K1A-F: 5′-AGATTCCCTAACCTCAAC CAGA-3′，circPIP5K1A-R: 5′-CGAATGTTCTTGCC ACCTGC-3′；PIP5K1A-F: 5′-CCTCATGCAAGATTTC TACGTGG-3′，PIP5K1A-R: 5′-GGCCGGATACCAAA TAGCTCC-3′；GAPDH-F: 5′-GAAGGTGAAGGTCGG AGTC-3′，GAPDH-R: 5′-GAAGATGGTGATGGGAT TTC-3′；U6-F: 5′-AGGGGCCATCCACAGTCTTC-3′， U6-R: 5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。PCR設置程序為：94°C預熱5 min；35個循環(94°C 變性30 s，54°C 退火45 s，72°C 延伸1 min)； 72°C、10 min。反應結束后，分別以U6和GAPDH為內參照，采用2法量化circPIP5K1A和PIP5K1A的相對表達水平。

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CCK-8檢測 取已轉染的SCC15和CAL27細胞接種在96孔板，培養48 h后，每孔加入10 μl CCK-8溶液，并孵育1 h，用酶標儀測定波長為450 nm處的吸光度值。

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集落形成實驗 取已轉染的SCC15和CAL27細胞分別接種到24孔板(300個細胞/孔)中，常規培養2周后，用PBS洗滌細胞2次并用甲醇固定， 結晶紫染色后顯微鏡下計數集落數，以肉眼可見細胞團或>50個細胞的細胞團為一個集落。

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Annexin V

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FITC/PI染色 取已轉染的SCC15和CAL27細胞分別接種到35 mm細胞皿(1×10個/孔)中，常規培養48 h。收集細胞，按照試劑盒說明書，進行Annexin V-FITC和PI染色，然后用流式細胞儀分析細胞凋亡情況。

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細胞遷移和侵襲實驗 取已轉染的SCC15和CAL27細胞經重懸浮后，分別接種于鋪或未鋪基質膠的Transwell上室中(100 μl細胞懸浮液，5 000個/孔)，下室中添加600 μl含10%胎牛血清的培養基，常規培養24 h。擦除膜上層面的細胞，用4%多聚甲醛固定膜下層面的細胞后，0.1%結晶紫染色30 min，顯微鏡下取6個隨機視野拍照并對細胞計數。

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Western blot 用RIPA裂解液提取細胞的蛋白并用BCA法定量蛋白濃度。每個樣本取60 μg蛋白行SDS-PAGE凝膠電泳分離并將分離的蛋白轉移至甲醇預活化的PVDF膜。用5%脫脂牛奶封閉PVDF膜上的蛋白后，室溫孵育孵育一抗(鼠抗β-catenin，1 ∶1 000；兔抗Wnt1，1 ∶2 000；兔抗GAPDH，1 ∶4 000)2 h，TBST洗滌膜后，室溫孵育HRP標記的抗鼠(1 ∶1 000)或抗兔(1 ∶2 000) 二抗1 h，TBST再次洗滌膜后，用ECL法顯影條帶，并用Quantity One 軟件分析條帶的灰度值。

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LiCl處理 取已轉染siR#1的SCC15和CAL27細胞，用10 ng/ml LiCl(Wnt/β-catenin信號激動劑)預處理30 min，分別培養處理后，用CCK-8法、集落形成實驗、Transwell法和Annexin V-FITC/PI染色法檢測細胞活力、細胞集落數、細胞遷移與侵襲和細胞凋亡情況。

2 結果

2.1 circPIP5K1A在OSCC組織和細胞中上調表達

RT-qPCR實驗結果顯示：與癌旁組織相比，OSCC組織中circPIP5K1A表達增加(圖1A，

t

=8.736，

P

<0.05)；與HOK細胞相比，OSCC細胞株SCC15和CAL27中circPIP5K1A表達均增加(圖1B，

F

=46.894，

P

<0.05)。另外，RNase R處理導致PIP5K1A mRNA降低(圖1C，

t

=11.325，

P

<0.05)而不影響circPIP5K1A的表達。

圖1 circPIP5K1A在OSCC組織和細胞中的表達情況

2.2 沉默circPIP5K1A抑制OSCC細胞的細胞活性和集落形成并促進凋亡

首先將siR#1和siR#2轉染至SCC15以及CAL27中，與轉染si-NC比較，轉染siR#1和siR#2的SCC15和CAL27細胞中circPIP5K1A表達均降低(

F

=42.365、

F

=54.192，

P

<0.05)，且siR#1的效果明顯，后續實驗選擇siR#1作為si-circPIP5K1A，見圖2A、B。然后觀察沉默circPIP5K1A表達對OSCC細胞活性、集落形成與凋亡的影響，結果顯示，與轉染si-NC比較，轉染si-circPIP5K1A能降低OSCC細胞活性(圖2C，

t

=6.379，

t

=7.624)、集落形成數(圖2D，

t

=9.165，

t

=11.832)并促進細胞凋亡(圖2E，

t

=13.478，

t

=12.154)(均

P

<0.05)。

圖2 沉默circPIP5K1A對OSCC細胞活性、集落形成與細胞凋亡的影響

2.3 沉默circPIP5K1A抑制OSCC細胞遷移與侵襲

實驗結果顯示，與轉染si-NC比較，轉染si-circPIP5K1A能降低SCC15和CAL27細胞的遷移(

t

=10.176，

t

=14.625)與侵襲(

t

=12.364，

t

=16.852)(均

P

<0.05)，見圖3。

圖3 沉默circPIP5K1A對OSCC細胞凋亡的影響 ×200A：細胞遷移的檢測結果； B：細胞侵襲的檢測結果；與si-NC比較：*P<0.05

2.4 沉默circPIP5K1A降低OSCC細胞Wnt/β-catenin信號活性

Western blot實驗結果顯示，與轉染si-NC比較，轉染si-circPIP5K1A能降低SCC15和CAL27細胞中Wnt1和β-catenin蛋白表達(

P

<0.05)，見圖4。

圖4 沉默circPIP5K1A對OSCC細胞中Wnt1和β-catenin蛋白表達的影響

2.5 LiCl能逆轉沉默circPIP5K1A對OSCC細胞活性、集落形成、細胞凋亡、細胞遷移與侵襲的作用

與si-circPIP5K1A組比較，si-circPIP5K1A+LiCl組SCC15和CAL27細胞的細胞活性(圖5A，

t

=5.125，

t

=5.837)、集落形式能力(圖5B，

t

=11.362，

t

=9.763)、遷移(圖5D，

t

=7.158，

t

=8.693)與侵襲(圖5E，

t

=8.602，

t

=7.536)能力均增強(均

P

<0.05)，凋亡降低(圖5C，

t

=7.189，

t

=6.894)(

P

<0.05)。

圖5 LiCl對已轉染si-circPIP5K1A的OSCC細胞的細胞活性、集落形成、細胞凋亡、細胞遷移與侵襲的影響

3 討論

OSCC是最常見的惡性腫瘤之一，且患者的發病年齡呈年輕化趨勢。OSCC一般采用手術切除后輔以放化療的治療模式，但目前此類腫瘤的整體預后較差，其主要原因是OSCC細胞具有高速生長和高速轉移的特性。因此，研究OSCC細胞的生長與轉移機制對 OSCC的治療策略的制定具有重要意義。

circRNAs是一類獨特的環狀結構的內源性非編碼RNAs，其在腫瘤的發生和發展過程中發揮著重要作用。如：circRNA_100290、circ_0109291和circPVT1等circRNAs在OSCC組織和細胞中高表達，抑制其表達能降低OSCC細胞增殖與遷移。circRNAs家族成員龐大，在OSCC進展中，有眾多具有抑癌或促癌功能的circRNAs未被鑒定。本研究顯示circPIP5K1A在OSCC組織和細胞中上調表達，而沉默circPIP5K1A可降低OSCC細胞的細胞活力、集落形成、遷移與侵襲并促使細胞凋亡，這一結果提示，靶向抑制circPIP5K1A表達可能是潛在的OSCC治療策略。

Wnt信號傳導是由配體蛋白Wnt和膜蛋白受體結合后而激發的一組信號轉導途徑，β-catenin是Wnt信號通路的主要組成部分。Wnt/β-catenin信號通路激活在OSCC發生和進展中起著重要的促進作用，并且有已有研究報道抑制Wnt/β-catenin信號活性能抑制OSCC細胞增殖與轉移。本研究結果顯示，沉默circPIP5K1A表達能抑制Wnt/β-catenin信號通路關鍵蛋白Wnt1和β-catenin的表達，因此推測沉默circPIP5K1A表達可能通過抑制Wnt/β-catenin信號活性來發揮對OSCC細胞生長與轉移的抑制作用。為證實這一推測，本研究進一步采用Wnt/β-catenin信號激動劑LiCl處理已轉染si-circPIP5K1A的OSCC細胞，結果顯示，LiCl能部分逆轉沉默circPIP5K1A對OSCC細胞的細胞活力、集落形成、細胞遷移與侵襲的抑制作用和凋亡的促進作用。以上結果說明，沉默circPIP5K1A至少是部分通過抑制Wnt/β-catenin信號活性來發揮抗OSCC的作用。

另外，circRNAs通常作為miRNAs的內源競爭RNA(competing endogenous RNAs，ceRNA)來發揮“miRNA海綿作用”。本研究對與circPIP5K1A具有直接作用的miRNAs并未探討。另外，本研究中Wnt/β-catenin信號通路為circPIP5K1A的下游通路，且Wnt/β-catenin信號激動劑LiCl并不能完全逆轉沉默circPIP5K1A的抗OSCC作用，說明沉默circPIP5K1A依然存在其他具有調節OSCC細胞的細胞活力、集落形成、遷移、侵襲以及細胞凋亡的信號通路。