七葉皂苷鈉對膽管結扎誘導的肝纖維化作用研究

王瑋琛，周大臣，崔 笑，侯 輝，張 彬

梗阻性黃疸(obstructive jaundice，OJ)是由于膽管管壁堵塞或膽管狹窄所致的急性膽汁膽管淤積癥而引起的一種全身性的機體病理或生理功能改變，是一種臨床常見癥狀，且對肝臟損傷最嚴重，易引起肝纖維化肝硬化。OJ常見的病因主要是膽管結石、膽管惡性腫瘤、胰頭部惡性腫瘤等。真核細胞翻譯起始因子4E(eukaryotic translation initiation factor 4E，eIF-4E)是真核細胞翻譯起始因子，廣泛分部于細胞質與細胞核中，可與mRNA 5’端 7-甲基鳥苷(7-methylguanosine，m7G)帽狀結構特異性結合，從而介導翻譯，其在多種疾病中起到調節作用。肝纖維化的疾病進程中受到了多種蛋白的調控，但是eIF-4E是否參與了OJ所引起的肝纖維化過程，目前并不清楚。

七葉皂苷鈉(soudium aescate,SA)具有消炎、減少滲出、改善水腫等作用，對急性肺損傷、肺纖維化及急性肝損傷有保護作用。但SA對OJ引起的肝纖維化的作用尚未見報道。因此，該研究以大鼠為實驗對象，進而驗證SA對梗阻性黃疸所引起的肝纖維化病理生理過程的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

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實驗動物 54只雄性、健康、適齡的SD大鼠，體質量200～250 g，購自安徽醫科大學動物實驗中心，動物使用許可證號為SYXK(皖)2020-001。

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試劑 SA(山東綠葉制藥有限公司)；七氟醚(美國艾伯維公司)；Masson染色液(北京索萊寶有限公司)；Ⅰ型膠原蛋白抗體(collagenⅠ，COL-Ⅰ)、Ⅲ型膠原蛋白抗體(collagen Ⅲ，COL-Ⅲ) (武漢博士德生物工程有限公司)；P-4EBP1抗體、 eIF-4E抗體(美國Cell Signaling Technology公司)；免疫組化試劑盒(北京中山金橋有限公司)。丙氨酸氨基轉移酶(alanine aminotransferase，ALT)、天冬氨酸氨基轉移酶(aspartate aminotransferase，AST)、總膽紅素(total bilirubin，TBIL)檢測試劑盒(廈門侖昌碩生物科技有限公司)。

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主要儀器 高速低溫離心機(美國Eppendorf公司)；熒光正置顯微鏡(德國ZEISS公司)；冷凍切片機(賽默飛世爾科技公司)。

1.2 方法

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動物分組、模型建立與給藥 將大鼠進行隨機分為3組，每組各18只：假手術組(Sham組)開腹后暴露大鼠膽總管后不予結扎僅行關腹。膽管結扎開腹后暴露大鼠膽總管后于膽總管十二指腸匯合部及次級膽管交匯處分別用4-0絲線結扎后關腹。術前12 h所有大鼠禁食水，七氟烷吸入麻醉后行膽管結扎，暖燈復蘇后，予以正常飲食。術后12 h內大鼠尿液變黃即造模成功。將造模成功的大鼠隨機分為OJ組及SA組。SA組術后每日腹腔注射SA 3.6 mg/kg(溶于生理鹽水配制為1 mg/ml溶液)。Sham組、OJ組應在相同的時間段內予以等量的生理鹽水溶液腹腔注射。藥物干預7 d后對大鼠標本進行采集。

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標本采集 大鼠稱重后，予以七氟烷進行麻醉，于大鼠門靜脈處穿刺采取2 ml血液，離心15 min取上清液后手術切取大鼠肝臟并于-80 ℃凍存。

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肝臟組織病理學檢查 將成年大鼠的肝臟組織制成石蠟切片。HE染色:切片于甲基二甲苯中進行脫蠟,并通過下降濃度的乙醇進行水化。蘇木精、伊紅染色后,用一定上升濃度的乙醇脫水,二甲苯漂洗后,加入樹脂密封。光鏡下可以進行病理學的觀察。Masson石蠟染色:前期脫水石蠟水化染色步驟同前,而后將切片依次經Weigert鐵蘇木精、酸性乙醇染色分化液、Masson染色藍化液、麗春紅品紅染色液、磷酸鉬溶液、固綠染色液、弱酸工作液特殊處理，再進行脫水操作，步驟同HE染色。二甲苯脫水漂洗后樹脂封片。正置顯微鏡鏡下觀察,采集所需圖像并進行分析。

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血清指標檢測 將離心好的血清依照試劑盒步驟依次進行操作，測量ALT、AST、TBIL水平。

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免疫熒光 大鼠肝組織冰凍切片常溫復溫40 min。山羊血清封閉，孵育一抗，切片4 ℃過夜。避光孵育熒光二抗。DAPI復染，熒光封片劑封片。熒光光學顯微鏡鏡檢,采集所需光學圖像并對其進行分析。

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肝臟組織免疫組化 切片脫蠟，置于枸櫞酸鈉緩沖液中(含0.05% Tween-20,pH6.0),在高壓鍋內加壓直至煮沸后進行抗原修復。切片滴加過氧化氫與甲醇的混合液封閉過氧化物酶，經1% trition10-X破膜10 min,于室溫滴入山羊血清溶液封閉2 h,而后滴加一抗，將切片組織置于濕盒中于4 ℃過夜,次日室溫孵育二抗,DAB顯色，用蘇木精復染,乙醇脫水,二甲苯漂洗后封片。正置顯微鏡鏡檢,采集所需圖像并進行分析。

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7

肝臟蛋白Western blot 提取肝臟組織勻漿上清液后，按BCA試劑盒說明書步驟測定蛋白濃度。配制12%的SDS-PAGE 凝膠，經電泳、轉膜后以5% BSA封閉2 h，加入一抗于4 ℃孵育過夜。第2天于室溫二抗孵育2 h，顯影。

1.3 統計學處理

采用GraphPad prism 8.0統計軟件進行數據分析，兩組之間數據采用

t

檢驗進行比較，多組間數據比較采用單因素方差分析。每組實驗均重復3次，

P

<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 血清指標測定結果

3組大鼠的血清ALT、AST、TBIL差異均有統計學意義(

F

=50.56、27.82、59.50，

P

<0.01)。與Sham組比較，OJ組ALT、AST、TBIL升高(

t

=10.06、17.18、34.29，

P

<0.05)；與OJ組比較，SA組ALT、AST、TBIL均有一定程度降低(

t

=8.35、2.63、15.30，

P

<0.05)。見圖1、2。

圖1 3組大鼠血清ALT、AST水平比較

圖2 3組大鼠血清TBIL水平比較

2.2 肝臟組織病理觀察及免疫熒光結果

Sham組的大鼠肝臟形態結構正常。OJ組腹腔可見少量淡黃色腹水，膽管擴張，肝臟腫大粗糙，質地韌。HE染色可見Sham組肝實質規整，有形態大小正常的肝細胞和肝竇。OJ組肝索紊亂，肝細胞變性和嗜酸性粒細胞、匯管區內可見膽管增生，實質單核炎性浸潤且周圍出現纖維條索Masson染色，Sham組膠原較少，單純結扎組膠原廣泛出現呈條索狀。SA組腹腔仍可見少量腹水，膽管擴張，肝臟表面顆粒較OJ組細小，質地稍韌；HE染色肝細胞的變性及嗜酸性粒細胞較OJ組均減少，Masson染色膠原纖維表達少于OJ組，見圖3。免疫熒光結果顯示，SA組較OJ組Col-Ⅰ、Col-Ⅲ 的表達均有一定程度的減少。對熒光強度進行分析，各組Col-Ⅰ、Col-Ⅲ的熒光強度差異有統計學意義(

F

=9.129、12.72，

P

<0.05)且OJ組較Sham組Col-Ⅰ、Col-Ⅲ的熒光強度顯著增加(

t

=3.664，P<0.01),經SA干預后Col-Ⅰ、Col-Ⅲ的熒光強度出現下降(

t

=7.430，

P

<0.01)。見圖4、5。

2.3 Western blot以及免疫組化結果

3組大鼠肝臟組織中eIF-4E、P-4EBP1表達差異有統計學意義(

F

=8.962、7.421，

P

<0.01)，而4EBP1的表達差異無統計學意義(

F

=0.377，

P

=0.692)，見圖6。eIF4E、P-4EBP1蛋白的表達水平Sham組表達水平最高，與OJ組比較差異有統計學意義(

t

=2.827、3.801

P

<0.05)；SA組eIF-4E、P-4EBP1兩種蛋白表達均升高(

t

=2.245、2.889，

P

<0.05)。Sham組可見eIF4E及P-4EBP1在細胞質及胞核中表達。OJ組可見細胞核中eIF4E及P-4EBP1在細胞核的表達減少，而胞質中仍可見部分表達。SA組eIF4E及P-4EBP1的表達少于Sham組，但在細胞核中的表達多于OJ組。而4EBP1在三組大鼠肝細胞中均有表達，且分布與胞質及胞核中，在肝細胞中差異并不顯著。見圖7。

圖3 3組大鼠的視檢、HE染色(×200)、Masson染色(×200)

圖4 3組免疫熒光結果 ×400

圖5 3組免疫熒光COL-Ⅰ、COL-Ⅲ熒光強度統計圖

3 討論

肝纖維化通過調控細胞外基質沉積的綜合信號網絡發生。在此過程中，肝星狀細胞被激活，并被誘導表現出收縮、增殖和成纖維細胞樣表型，導致膠原和其他細胞外基質成分的積累。其中以Col-Ⅰ、Col-Ⅲ占主導地位，這些物質的持續刺激積累導致肝結構和肝正常功能的破壞。而Col-Ⅰ、Col-Ⅲ表達則可進一步推動肝星狀細胞激活，從而使肝纖維化進一步進展。因此Col-Ⅰ、Col-Ⅲ的表達反映了肝纖維化程度。SA作為抗炎抗氧化藥物在臨床上一直被應用，隨著對該藥的研究進一步深入，發現SA對肝癌細胞存在抑制作用，對肺纖維化存在抗纖維化作用。本研究HE、Masson染色顯示，SA干預后肝臟結構規整，炎性細胞浸潤減少，膠原的表達量減少，免疫熒光實驗顯示經過SA干預后Col-Ⅰ、Col-Ⅲ的表達下調。提示SA在OJ大鼠肝臟的存在抗纖維化作用。

圖6 3組eIF4E、P-4EBP1、4EBP1肝臟組織表達水平

圖7 3組免疫組化eIF-4E、P-4EBP1、4EBP1結果 ×200

肝細胞損傷后炎癥和固有免疫系統激活導致肝星狀細胞激活和細胞外基質(ECM)分離和沉積繼而引發肝纖維化。因此減少肝細胞的損傷繼而減少免疫系統的的激活及炎癥的發生則可有效地減緩肝纖維化的發生。Du et al研究證實SA對急性肝損傷存在一定的保護機制。在本研究中OJ大鼠的肝細胞因膽汁淤積，導致正常肝細胞因內毒素及炎癥反應等作用受到破壞，而經SA處理后的大鼠血清ALT、AST、TBIL下降，并且肝臟病理鏡檢下炎性細胞的浸潤減少。說明肝細胞在SA的作用下破壞減少，SA對肝細胞存在保護作用。

eIF-4E在mRNA的翻譯起始過程具有重要的調節作用。eIF-4E與eIF-4G形成復合物，可以啟動Cap依賴性mRNA的翻譯起始過程，為細胞增殖及相關活動提供物質基礎。但是eIF-4E:eIF-4G的結合，受蛋白4EBP1的動態調控。4EBP1的Thr37/46激酶的磷酸化狀態，可以競爭性的與EIF4E結合，從而形成4E”4EBP1復合物，進而抑制4E”4G的結合，從而抑制mRNA 的翻譯。本研究免疫組化及Western blot的結果證實，膽管結扎可在大鼠體內的肝臟中抑制4EBP1 的磷酸化以及下調eIF-4E的表達。因此推斷，膽道梗阻引起的膽汁淤積，損傷了大鼠的肝細胞正常的mRNA翻譯過程，應引起特定蛋白的合成障礙。但是經SA處理后，研究結果證實，大鼠肝臟內肝細胞4EBP1的磷酸化增高并且4E的表達水平增高，對緩解膽道梗阻所引起的mRNA翻譯功能障礙具有一定的作用。所以課題組認為，SA可以緩解梗阻性黃疸基礎上繼發對肝臟合成功能障礙，從而可以用于緩解梗阻性黃疸患者的肝功能損傷。

目前臨床治療肝纖維化尚無特效藥物，本研究論證了SA在膽管結扎大鼠肝臟中的保護及抗纖維化作用，后續需完善細胞實驗，望今后為OJ所致的肝纖維化提供新的治療思路。