DHEA與褪黑素在繼發性早泄疾病中的表達及意義

李 虎，張 耀，高晶晶，張賢生,3

早泄(premature ejaculation，PE)是常見的男性性功能障礙疾病之一，不僅影響男性生活質量及精神方面，還影響著夫妻雙方。PE可以分為4種類型：原發性PE(lifelong PE，LPE)、繼發性PE(acquired PE，APE) 、變異性PE及主觀性PE。脫氫表雄酮(dehydroepiandrosterone，DHEA)及褪黑素作為神經及內分泌系統的兩大物質，在人體中發揮著重要作用。白天DHEA大量分泌對人體清醒及活動起著重要作用，傍晚DHEA的分泌逐漸減緩，松果體會開始讓褪黑激素進行大量分泌，兩者間形成微妙的消長。DHEA作為一種雄激素，對男女雙方都有著一定的影響。近年來，褪黑素對男性生殖系統的影響也有報道。但DHEA及褪黑素在PE中的作用的研究卻很少。 因此，該文通過對DHEA及褪黑素與APE的關系，并分析其與疾病嚴重程度的關系，進一步闡述DHEA及褪黑素在APE中的研究意義。

1 材料與方法

1.1 病例資料

2020年5-10月從安徽醫科大學第一附屬醫院泌尿外科及健康中心招募志愿者并提供參與研究的書面知情同意書。共有57例研究對象符合入組條件，其中APE有27例，無PE有30例。兩組分為APE組和對照組。APE組年齡20～50(36.29±9.87)歲，IELT(2.55±0.73)min。對照組年齡20～49(31.48±10.77)歲，IELT(8.91±3.88)min。根據中國PE性功能評價量表-5(CIPE-5)評分，APE患者分為輕度7例，中度14例，重度6例。納入標準：年齡在20至60歲之間，在過去6個月內有穩定的性生活,國際勃起功能指數(IIEF- 5)>22。排除標準：精神病或神經病史，骨盆/會陰部創傷，肝或腎功能衰竭，尿路感染，慢性前列腺炎，解剖異常以及可能影響性功能的慢性疾病。接受5-羥色胺(5-HT)再攝取抑制劑、α-受體阻滯劑、磷酸二酯酶抑制劑、抗膽堿能藥、抗精神病藥和補充維生素D的參與者也被排除在研究之外。本研究經安徽醫科大學第一附屬醫院倫理委員會批準。

1.2 主要試劑與儀器

無水乙醇購自上海臻諾生物科技有限公司；TRIzol購自哈爾濱新?；驒z測有限公司；氯仿購自上海穆百生物科技有限公司；異丙醇購自上海穆百生物科技有限公司；Rnase-free水購自澤葉生物科技有限公司。qPCR試劑盒購自北京啟衡星生物科技有限公司；逆轉錄試劑盒購自上海研卉生物科技有限公司；Elisa試劑盒購自江蘇酶免實業有限公司；qPCR儀購自北京科譽興業科技發展有限公司；低溫離心機購自長沙巴溪儀器有限公司；酶標儀購自上海聯邁生物工程有限公司。

1.3 方法

患者在研究開始之前被告知研究目的、內容及方法，如同意參加本研究將簽署知情同意書，并在專業醫護人員指導下填寫調查問卷及標本采集的準備。問卷調查內容包括：PE診斷量表(PEDT)、CIPE-5、IIEF- 5、自我估計陰道內射精潛伏期(自我估計IELT) (從開始插入陰道到陰道內射精的時間)。

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標本采集及處理 研究對象均在隔夜空腹>8 h 后于第二天清晨7:00～8:00采集外周靜脈血，在室內常溫下靜置 20 min，外周血進行離心，3 500 r/min、30 min，分離血清和外周血沉淀物，儲存在-80 ℃環境下待測。

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外周血RNA的提取 向外周血沉淀物中加入1 ml TRIzol，15～30 ℃放置5min，每使用1 ml TRIzol加200 μl氯仿，蓋好管蓋，劇烈振蕩15 s，室溫放置3 min，4 ℃、12 000 r/min離心15 min，樣品分為3層，RNA主要在水相中，把水相(約500 μl)轉移到新管中，在得到的水相溶液中加入等體積異丙醇，混勻，室溫放20～30 min，4 ℃、12 000 r/min離心10 min，去上清液，離心后在管側和管底形成膠狀沉淀，加入1 ml 75%乙醇(Rnase-Free 雙蒸水配制)洗滌沉淀，每使用1 ml TRIzol至少用1 ml 75%乙醇對沉淀進行洗滌，洗滌2次，風干沉淀，加入30～50 μl 雙蒸水，溶解沉淀。

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反轉錄 使用AG反轉錄試劑盒對人體外周血提取出的RNA進行反轉錄實驗，實驗所有操作均在冰上進行，操作均嚴格按照說明書進行。使用反轉錄成功的cDNA進行后續的qPCR實驗

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qPCR實驗 使用Sigma 2X qPCR Master Mix對反應進行標準化。SYBR 2X qPCR預混液用于包含2 μl cDNA模板的反應混合物中：2 μl每種引物(每 μl全部含2.5 μmol/L的Piry-Forward和Piry-Reverse)； 0.4 μl的ROX緩沖液(2X)； 10 μl的SYBR緩沖液(2X)； 3.6 μl的Rnase-free水，用于20 μl的體積反應。反應條件：預變性95 ℃，變性95 ℃、10 s，退火58 ℃、30 s，延伸72 ℃、30 s，共計45個循環，最后繪制melt curve，記錄CT值，計算表達量。

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ELISA檢測 提前準備好待測的人體血清以及標準品，根據濃度進行不同比例的稀釋，分別設空白孔、標準品孔和待測樣品孔，在酶標板上標準品精確加樣50 μl，待測樣本孔中加稀釋液40 μl，樣本加10 μl，封板膜封板放37 ℃溫育30 min，1x的洗滌液洗滌板子，重復5次，拍干，加入酶標試劑50 μl，空白孔除外，溫育半小時，再次洗滌，隨后在每孔加入顯色劑A 50 μl，顯色劑B 50 μl，輕輕震蕩混勻，37 ℃避光顯色10 min，每孔加入終止液50 μl，終止反應，以空白孔調零，450nm波長測量各孔吸光度(optical density, OD值)

1.4 PE診斷及嚴重程度的評判標準

根據PEDT評分診斷是否屬于PE(≥11分為PE，=9分或10分疑似PE，≤8分不屬于PE)。存在PE的患者若符合國際性醫學學會(ISSM)委員會對APE的定義標準，則診斷為APE。根據CIPE-5積分，PE患者可以分為輕度、中度、重度3種類型(輕度大于13分，重度10～13分，重度5～9分)。

1.5 統計學處理

應用SPSS19.0統計軟件進行分析，數據首先進行正態性檢驗，如數據符合正態分布則采用

t

檢驗，否則采用Mann-Whitney U 檢驗。兩變量若為正態分布數據采用 Pearson 相關分析，兩變量若為非正態分布數據采用Spearman 相關分析。

P

<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 比較APE組與對照組外周血DHEA及褪黑素受體基因的表達

選取30例對照組患者與27例APE患者的外周血，提取RNA進行反轉錄以及qPCR實驗，來檢測DHEA以及褪黑素受體在外周血中的基因表達，APE患者的外周血中DHEA的基因表達低于對照組(

P

<0.01)，褪黑素受體1的基因表達低于對照組(

P

<0.01)，差異均有統計學意義，見圖1。此外，褪黑素受體2的基因表達量過低無法統計。

圖1 對照組與APE組外周血DHEA及褪黑素受體1基因的表達差異與對照組比較：**P<0.01

2.2 比較APE組與對照組血清中DHEA及褪黑素分泌濃度的差異

選取30例對照組患者與27例APE患者的外周血，離心取血清，進行ELISA實驗檢測血清中DHEA以及褪黑素的分泌濃度，顯示APE患者血清中DHEA分泌的濃度低于對照組[(4.84±2.07)ng/ml

vs

(6.19±1.78) ng/ml，

P

=0.011]，血清褪黑素的分泌濃度也低于對照組[(5.55±2.30) pg/ml

vs

(13.36±2.78) pg/ml，

P

<0.001]，差異均有統計學意義,見圖2。

圖2 對照組與APE組血清中DHEA及褪黑素分泌濃度的差異與對照組比較：*P<0.05，***P<0.001

2.3 分析APE患者血清中DHEA及褪黑素的濃度與APE疾病嚴重程度的相關性

選取APE組患者外周血DHEA及褪黑素的分泌濃度與CIPE-5評分進行分析，顯示APE組患者血清中DHEA的濃度與CIPE-5評分不相關(

r

=0.154 6，

P

=0.441 3),但褪黑素濃度的變化與CIPE-5評分相關，差異有統計學意義(

r

=0.773 8，

P

<0.05)，見圖3 。

圖3 APE患者血清中DHEA及褪黑素的分泌濃度與APE疾病嚴重程度的相關性

3 討論

在PE疾病中，APE相比于LPE更為常見，然而其影響因素及病理機制尚未完全闡述。針對APE的治療，除了針對已知病因進行治療，還包括藥物治療、行為心理治療、手術治療等。目前，藥物治療有幾種選擇，如5-HT再攝取抑制劑(達泊西汀、氟西汀、帕羅西汀等)和局部麻醉劑，已在臨床上廣泛使用。雖然一些研究表明這些方法取得了顯著的成功，然而也有一定的副作用，包括惡心和腹瀉、頭痛、頭暈、性欲減退、無射精、勃起功能障礙。與此同時，行為心理療法的結果是不受控的，手術治療也仍處于探索階段。在臨床上，APE的男性比LPE的男性更有可能尋求醫學治療。本研究通過分析DHEA及褪黑素與APE的關系，尋找新的病理生理因素，進而闡明這種性功能障礙的潛在原因，從而發現新的治療靶點。

本研究中，APE組與對照組外周血的DHEA基因表達及血清中分泌的含量，均具有顯著差異，這在一定程度上說明了DHEA在APE的發生與發展過程中起到了一定的作用。DHEA是一種神經活性類固醇，通過調節5-HT、DA和去甲腎上腺素的釋放而具有神經生物學作用。在前腦，DHEA作為神經甾體，負調節GABA受體的功能從而可以激活5-HT神經元的活動。5-HT作為神經遞質，在PE的發生發展過程中具有重要作用。中樞神經系統存在著5-HT神經元，釋放5-HT到突觸間隙，大部分被突觸前神經末梢重攝取，進入囊泡再貯存，另一部分則被線粒體膜上的單胺氧化酶(monoamine oxidase，MAO)所氧化。有研究為了探討DHEA是否調節DA和5-HT的代謝，通過對大鼠給藥后2 h后檢測大鼠紋狀體(corpus striatum，CS)和伏隔核(nucleus accumbens，NAc)中神經遞質及其代謝物的含量，發現DHEA治療顯著降低了CS的DA周轉(高達33%)，但增加了5-HT周轉(高達76%)，MAO活性也降低了。臨床上，通過給予抑郁癥患者5-HT再攝取抑制劑，可以顯著提高血清中DHEA的濃度，表明內源性DHEA在5-HT系統中可能存在相互作用。

此外，本研究顯示，APE的人群中褪黑素受體1基因的表達與血清褪黑素分泌濃度與對照組對比顯著降低，顯示APE的病因與褪黑素的改變可能存在一定的相關性。褪黑素是一種5-HT衍生的吲哚胺，在交感神經的控制下于夜間合成。它的生產是通過5-HT的乙?；图谆铣傻?。色氨酸羥化酶作為5-HT的合成限制酶，在松果體細胞中也可以表達，然而5-HT的代謝途徑和褪黑素的關系尚未得到很好的闡述。在以往的研究中，褪黑激素水平被觀察到在焦慮、睡眠剝奪和情緒低落的情況下會降低，而這些疾病也都于中樞5-HT系統的紊亂有關。最近有研究通過對LPE的病人口服5-HT再攝取抑制劑進行治療，發現血液褪黑素濃度顯著升高，表明5-HT的攝取與褪黑素的合成具有相關性。此外，本實驗分析了血清中褪黑素濃度與CIP-5評分顯著相關(

r

=0.773 8，

P

<0.05), 然而DHEA與CIPE-5評分無相關性，提示血清褪黑素濃度的變化可作為APE疾病嚴重程度的標志物。

綜上所述，APE與DHEA以及褪黑素具有密切的關系，DHEA與褪黑素在APE的發生與發展過程中起到重要作用。DHEA通過調控5-HT神經元活動來影響5-HT的含量，可能會導致APE的發生。褪黑素作為5-HT的產物或許可以反映中樞系統中5-HT含量的變化以及進一步調節5-HT系統。這些內在可能存在的機制需要深入研究，進而為APE的治療提供新的方向。