LSS基因敲除小鼠的飼養、繁殖及基因型鑒定

李名聰，孫曉梅，李昱昊，周 宏，羅 欣，張勝權

甲羥戊酸代謝途徑是生物體內重要的代謝途徑之一，該途徑在各種酶的作用下利用乙酰輔酶A產生一系列產物包括甲羥戊酸(mevalonic acid，MVA)、羊毛固醇(lanosterol，LAN)等。LSS編碼羊毛甾醇合酶，這是上述途徑中的關鍵酶，能夠將氧鯊烯環化形成羊毛固醇。LSS雙等位基因突變會引起脫發伴智力低下(alopecia with mental retardation，APMR)綜合征、廣泛的先天性白內障。近期研究表明，LSS雙等位基因突變導致的組織羊毛固醇合成酶缺乏會引起稀毛癥和白內障。開發LSS缺陷狀態的動物模型可以從整體水平研究LSS蛋白的功能。由于LSS null小鼠胚胎致死性，尚未有白內障或稀毛癥小鼠模型。該研究針對LSS基因敲除小鼠的繁育飼養和基因型鑒定，對其方法進行探討和優化，為相關機制研究提供更好的LSS基因敲除動物模型。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

2017年12月從南京大學南京生物醫藥研究所引進3只無特定病原體(specific pathogen free，SPF)級C57BL/6品系小鼠，8 周齡，(20±2)g，2只雌鼠基因型是LSS基因敲除型雜合子(LSS)，1只雄鼠基因型是野生型(wide type，Wt)，實驗動物許可證號：SCXK(蘇)2015-0001。所有實驗動物的飼養與操作均符合國標及安徽省實驗動物中心管理飼養條例。

1.2 主要試劑

鼠尾基因型鑒定試劑盒(上海碧云天生物公司)；DL2000 bp DNA marker和Premix Taq (TaKaRa Taq Version 2.0 Plus dye)(大連寶生物工程有限公司)；瓊脂糖粉、引物和溴化乙錠(Ethidium bromide, EB)(上海生工生物工程股份有限公司)；抗β-actin抗體、抗LSS抗體(美國Santa Cruz公司)；辣根酶標記山羊抗兔IgG(北京中杉金橋生物技術有限公司)。

1.3 儀器

DYY-6C電泳儀(北京市六一儀器廠)，普通PCR儀(美國賽默飛公司)，全自動數碼凝膠圖像分析儀(上海勤翔科學儀器有限公司)

1.4 小鼠的飼養和信息記錄

LSS 基因敲除小鼠于安徽醫科大學實驗動物中心SPF級動物房內飼養與繁殖。飼養溫度18～22 ℃，相對濕度40%～70%，明暗循環12 h/d，自由飲食和飲水。小鼠籠盒、墊料、飼料和飲用水都經過高溫高壓消毒滅菌處理。每周換2次墊料，添加水和飼料，并且給予人道關懷。在繁殖籠標簽上，記錄鼠號、基因型、出生日期、合籠日期、父母本的鼠號、產仔日期和數量。在離乳籠標簽上，記錄籠號、基因型、數量、出生日期、離乳日期、死亡日期、父母本基因型。

1.5 小鼠組織基因組DNA提取

實驗前將DNA Extraction Solution 和 Enzyme Mix 按照比例(48 ∶2)充分混勻配制好消化液。用70%乙醇沖洗剪刀和鑷子，剪取0.2～1 cm的小鼠尾尖放入250 μl的PCR管中，加入50 μl消化液，需確保小鼠尾巴完全浸沒。將樣品置于PCR儀中，55 ℃孵育15 min，95 ℃孵育5 min。往上述樣品中加入50 μl Stop Solution，渦旋混勻，提取小鼠基因組DNA。

1.6 PCR擴增反應

引物是由南京大學南京生物醫藥研究所設計，并由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，LSS基因引物分別是Primer F：ACCTGGGCGGAGTCTAAGGAAG；Primer R：AAGGCTCTCCACTGTTTCAGAGCT。PCR擴增反應體系根據小鼠基因型鑒定試劑盒使用說明，按照25 μl反應體系進行擴增反應。分別加入：Premix Taq (TaKaRa Taq Version 2.0 Plus dye) 12.5 μl、F引物(10 μmol/L)1 μl、R引物(10 μmol/L)1 μl孔DNA模板1 μl、加入雙蒸水補足至25 μl。PCR反應循環體系設定為：① 預變性：94 ℃ 、 3 min ；② 94 ℃變性30 s、55 ℃退火30 s 、72 ℃延伸40 s[40 s/(kb·min)]，循環35次；③ 72 ℃、10 min終止反應。

1.7 1.6%瓊脂糖凝膠電泳和基因型結果判斷

0.4g瓊脂糖加入25 ml 1×瓊脂糖電泳緩沖液(TAE)中，加熱至完全溶解，稍冷卻至不燙手，加入2 μl溴化乙啶(EB)；上樣DNA樣本 5 μl，電泳電壓90 V，時間90 min。于化學發光凝膠成像系統中拍照觀察。擴增產物長度為328 bp左右條帶，為Wt；擴增產物有282 bp 和328 bp兩條電泳條帶則為雜合敲除小鼠(LSS)。

1.8 Western blot 檢測各組肝臟和皮膚組織中LSS蛋白的表達

取適量小鼠肝臟或皮膚組織置于冰冷的裂解液中提取總蛋白。用BCA蛋白濃度測定試劑盒進行蛋白定量，蛋白樣品與上樣緩沖液在沸水中煮沸10 min。采用10%十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳并轉至PVDF膜，5%脫脂牛奶室溫下封閉2 h，用TBST洗膜3次，與LSS一抗(1 ∶1 000)4 ℃過夜，次日用TBST洗膜3次，加入對應的山羊抗小鼠IgG(1 ∶20 000)室溫2 h，TBST洗膜3次，內參使用β-actin。ECL化學發光試劑進行顯影，Image J軟件測定吸光度值以計算蛋白表達水平。

1.9 小鼠生殖與繁育

當小鼠8周達到性成熟，采用雜合子與野生型小鼠以雄鼠和雌鼠1:2進行合籠擴繁。幼鼠經哺乳期21 d后進行分開飼養，出生8周左右進行下一步實驗。利用5只雜合子雄鼠和5只雜合子雌鼠進行擴繁，以野生小鼠(5雄/5雌)作為對照組進行擴繁獲得3個月內子代數。總產子數除以母鼠生產次數得到每窩平均產子數，將存活3周子代數除以總產子數計算3周存活率。

2 結果

2.1 小鼠基因型鑒定結果

F2代基因型鑒定部分結果如圖1A，其中1、2、4、5、6、9、10號出現1條328 bp的條帶，為野生型小鼠；3、7、8號分別產生328 bp 和282 bp 兩條條帶，為雜合子小鼠。將雜合子小鼠與異性雜合子小鼠進行合籠，得到子代小鼠基因型如圖1B，其中1、2、3、4號出現1條328 bp的條帶，為野生型小鼠；5、6號分別產生328 bp 和282 bp 兩條條帶，為雜合子小鼠。

圖1 小鼠基因型的PCR鑒定

2.2 基因敲除小鼠LSS蛋白表達情況

為了進一步確認PCR結果的準確性，選取PCR鑒定的野生型、雜合子小鼠，Western blot 檢測LSS蛋白在肝臟、皮膚組織中的表達量。結果如圖2所示，野生型和雜合子小鼠肝臟、皮膚中可見LSS蛋白表達，雜合子小鼠表達量低于野生型小鼠(

t

=8.266，

P

<0.01；

t

=5.539，

P

=0.000 5)。

2.3 小鼠的繁殖情況

F1代母鼠產下子代小鼠(F2)，F2代雜合基因敲除小鼠與野生型小鼠交配，成功的繁殖出F3代。LSS鼠與Wt鼠在體型方面相差無異，見圖3。LSS鼠配繁每窩平均產子數和子代3周存活率均低于Wt 鼠，差異有統計學意義(

t

=4.049，

P

<0.05；

t

=2.795，

P

=0.008 1)，見表1。

圖2 Western blot 法檢測LSS蛋白在野生型和雜合子小鼠肝臟和皮膚中表達水平

圖3 不同年齡的子代小鼠外觀A：出生3 d小鼠；B：出生3周小鼠；C：8周齡野生型和雜合子小鼠

表1 LSS缺失對小鼠繁殖的影響

3 討論

膽固醇對于哺乳動物細胞生長發育和分裂具有重要重要。在嚙齒動物妊娠期，母體膽固醇可以穿過胎盤影響胎兒的生長發育。依據孟德爾遺傳定律, 敲除雜合子基因型小鼠交配, 其子代可能出現野生型、敲除雜合子和敲除純合子3種基因型。Mori et al研究發現LSS純合敲除小鼠胚胎顯示異常間充質細胞，這些間充質細胞呈橢圓形，胞質小，細胞核大，處于未成熟狀態。純合敲除胚胎致死，該胚胎主要病理變化是器官發生缺陷、皮膚和神經組織以及主要內臟器官難以辨認。通過對LSS基因敲除小鼠生長繁殖性能的觀察結果顯示未得到LSS純合敲除小鼠，雜合子小鼠少于野生型小鼠，存活率也低于野生型小鼠，LSS缺失可能會影響該小鼠的生長或繁殖能力，有待后續進一步實驗。

皮膚病變、白內障和先天性異常通常與膽固醇合成途徑的酶遺傳缺陷有關。羊毛固醇合成酶在該途徑當中將(S)-2,3-環氧角鯊烯轉化為羊毛固醇。近年來研究表明LSS表皮特異性基因敲除小鼠因皮膚屏障功能低下，導致皮下發育不全而嚴重脫水致死。此外LSS還與一種罕見的常染色體隱形遺傳病神經外皮綜合征有關，其特征是發育不良和智力障礙或發育遲緩，通常伴有早發性癲癇相關。Zhao et al研究表明LSS是富于晶狀體的兩親性分子，在體外實驗使用羊毛固醇處理可以顯著降低預先形的蛋白聚體，有效降低白內障的嚴重程度。

因此引進了LSS基因敲除小鼠，按照SPF級標準進行飼養繁殖。采用較為簡單快捷、重復性較好的PCR方法，進行基因型鑒定。通過Western blot檢測得到雜合子小鼠LSS表達量在肝臟和皮膚中低于野生型小鼠，其結果與PCR方法鑒定的結果一致，說明應用PCR方法鑒定小鼠基因型結果可靠、可信。在飼養過程中，未得到LSS基因敲除純合子小鼠且獲得的雜合子小鼠比例低，所以在飼養和繁殖的過程中要格外注意。本次實驗，課題組采用雜合子小鼠雜交方式繁育，篩選所需基因型，野生型和雜合子小鼠可以進行對照造模，進行表型分析；剩余的雜合子小鼠可以用作保種再繁育以解決后續繁殖問題。