L-半胱氨酸對慢性間歇性低氧大鼠血壓和交感神經活動的影響

圣 豪，丁 揚，蔣 倩，余孝海，王烈成，鐘明奎

阻塞性睡眠呼吸暫停(obstructive sleep apnea, OSA)是一種累及多系統并造成多器官損害，嚴重威脅人類健康的常見睡眠呼吸障礙疾病。OSA是多種心腦血管疾病的獨立危險因素，對患者造成的傷害不可逆轉，包括高血壓、冠心病、心律失常、肺動脈高壓等，與OSA關系最為密切的是高血壓。OSA的損傷機制和特點是間歇性低氧(intermittent hypoxia，IH)，被認為是引起高血壓等心腦血管疾病的最為重要的因素。交感神經的過度激活和血管內皮的過度損傷是造成高血壓的重要因素。硫化氫( hydrogen sulfide，HS) 作為內源性信號分子在多個系統中均發揮重要的生物學作用。在心血管系統，HS在舒張血管、抑制血管重構和保護心肌等方面具有重要的生理作用，研究表明內源性HS和外源性HS供體化合物對高血壓、動脈粥樣硬化、心肌肥厚、心力衰竭和缺血/再灌注損傷等心血管疾病發揮保護作用。該研究旨在探討應用HS前體L-半胱氨酸( L-cysteine, L-cys)對IH所致的高血壓大鼠的作用及其機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

40只體質量為(230±30)g的雄性SD大鼠由濟南鵬躍實驗動物繁育有限公司[證書編號SYXK(WAN)2017-006]提供，并在安徽醫科大學動物設施中心飼養動物分籠飼養，動物飼養于12 h暗光循環標準條件下的實底聚丙烯籠子里，自由攝食和飲水，通風良好，溫度(23±2)℃，濕度(55±5)%，光照時間7:00～19:00。

1.2 主要儀器及試劑

測氧儀(CYS-1型數字式測氧儀，上海精宏實驗設備有限公司)；PowerLab 8/30數據采集分析處理系統(澳大利亞AD Instruments公司)；無創血壓測定分析系統(ALC-NIBP，上海奧爾科特公司)；醫用氧氣(濃度>99.9%)、氮氣(高純氮氣，濃度>99.99%)由合肥市醫用氧氣廠充裝；L-半胱氨酸 (L-cysteine，L-cys)購自美國Sigma公司。

1.3 方法

1

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3

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1

間歇性低氧模型的制備及分組 所有實驗大鼠均提前1周進行適應性飼養，隨機分為正常氧(Control)組、慢性間歇性低氧(CIH)組、正常氧L-cys干預(Control+L-cys)組和慢性間歇性低氧L-cys干預(CIH+L-cys)組，每組10只。參照課題組前期實驗，將CIH組和CIH+L-cys組大鼠放入低氧倉內，通過氮氣稀釋的原理，使低氧倉內的氧氣濃度降為環境濃度的21%，并通過氮氣和氧氣控制倉內的氧氣濃度。充入氮氣4 min，使低氧倉的最低氧氣濃度達到6%，并保持40 s，然后充入氧氣5 min，以重新充氧至21%，并維持整個循環9 min。低氧倉的氧氣濃度由氧氣探頭監控，開關時間由計時電路控制。進行間歇性低氧處理，每天8 h(9:00 am～5:00 pm)，連續15 d。對照組除了不放入低氧倉，其他處理與模型組相同。

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3

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2

評價腎交感神經活動(renal sympathetic activity，RSNA) 腹腔注射烏拉坦(800 mg/kg)和α-氯醛糖(40 mg/kg)混合麻醉，從大鼠腰腹部行豎行切口暴露腎臟等組織，用眼科剪刀和鑷子小心游離出腎交感神經，裝上事先準備好的電極來引導RSNA，經數據分析系統分析后，記錄數據并應用專業的數據分析系統分析處理RSNA，通過RSNA基礎值占最大值的比例來評價RSNA的水平。

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3

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3

血漿中HS、去甲腎上腺素(norepinephrine, NE)、胱硫醚β

-

合酶(cystathionine β

-

synthase, CBS)和胱硫醚γ

-

裂解酶(cystathionine γ

-

lyase, CSE)檢測 大鼠腹腔完全麻醉后，腹主動脈取血4～5 ml，肝素抗凝，離心10 min(3 000 r/min)，取上清液，-80℃保存。采用GENMED比色法測定血漿中HS的水平，ELISA法檢測NE水平和CBS、CSE活性。

2 結果

2.1 L-cys對慢性間歇性低氧對大鼠血漿中H

S水平的影響

與Contol組相比，間歇性低氧15 d后，CIH組大鼠血漿中HS含量[

F

=9.975，

P

<0.01]顯著降低；與CIH組相比，口服L-cys可顯著增加大鼠血漿中HS含量[

F

=9.975，

P

<0.05)]，而L-cys對正常大鼠血漿中HS含量有升高趨勢，但沒有顯著差異；4組大鼠血漿中CBS和CSE活性沒有顯著差異。見表1。

表1 慢性間歇性低氧對大鼠血漿中H2S含量、CBS和CSE活性的影響

2.2 L-cys對CIH大鼠血壓的影響

從IH第5天開始，CIH大鼠尾動脈SBP比間歇性低氧前升高；與Contol組相比，間歇性低氧15 d后，CIH組大鼠血壓顯著升高[

F

=233.1，

P

<0.05]。口服HS前體L-cys，對于正常大鼠血壓沒有影響；L-cys可抑制間歇性低氧引起的升壓作用(

P

<0.01)，但不能使慢性間歇性低氧大鼠的血壓完全恢復正常(

P

<0.01)，見圖1。

圖1 L-半胱氨酸對大鼠血壓的影響

2.3 L-cys對CIH大鼠交感神經活動的影響

與Contol組相比，間歇性低氧15 d后，CIH組大鼠RSNA[

F

=21.92，

P

<0.01]和血漿中NE含量[

F

=63.02，

P

<0.01]顯著升高。口服 L-cys，對于正常大鼠RSNA和血漿NE水平沒有影響；L-cys可抑制間歇性低氧引起的RSNA[CIH組

vs

CIH+L-cys組：

F

=21.92，

P

<0.05]和NE[CIH組

vs

CIH+L-cys組：

F

=63.02，

P

<0.05]增加的作用，但不能使CIH大鼠的RSNA [Control組

vs

CIH+L-cys組：

F

=63.02，

P

<0.01]完全恢復正常(圖2)。

3 討論

本研究顯示間歇性低氧可引起大鼠動脈血壓、交感神經活動和血漿NE水平顯著增加，血漿HS水平降低，提示間歇性低氧引起的高血壓可能與體內的HS水平下降有關；應用HS前體L-cys，增加內源性HS水平可抑制間歇性低氧所致的血壓升高和交感神經活動過度激活。

間歇性低氧是OSA的主要病理生理學特點和損傷機制，其特點是：①低氧程度嚴重，最低動脈血氧飽和度可降至20 %或更低；② 血氧飽和度一天之內會經歷巨大的變化，其幅度之大高于30%低于70%。人體對低氧條件的反應包括兩個過程：損害和適應，相比較而言，持續低氧的損害要比間歇性低氧對人體的損害更低，且人體更難以適應間歇性低氧。為了研究間歇性低氧與大鼠血壓升高的關系，Tamisier et al模擬OSA患者缺氧模式建立了間歇低氧實驗模型，給志愿者循環吸入低氧氣體(氧濃度13%，持續15 s，每2 min一次循環)，每天8 h，持續28 d，28 d后志愿者平均動脈壓顯著升高，停止吸入低氧氣體后，血壓仍可持續升高。Fletcher et al首先制作了可實施間歇低氧環境的實驗艙，從動物整體和系統水平證實了間歇低氧確可誘發大鼠高血壓。本實驗采用的間歇性低氧模式為9 min發生一次低氧，每一循環間歇性低氧艙內的最低氧濃度達到6%左右，持續時間為45 s左右，連續低氧15 d，大鼠血壓出現升高。

圖2 L-半胱氨酸對大鼠交感神經活動的影響

大量的研究表明，高血壓患者的主要特征之一是交感神經的過度激活，在高血壓疾病整個發展過程中都起著重要的作用。本研究顯示IH可引起大鼠RSNA和血漿中NE顯著升高，提示交感神經的過度激活可能是IH引起高血壓的發病機制之一。間歇性低氧會導致氧分壓降低和二氧化碳潴留，從而刺激中樞和外周化學感受器導致交感神經興奮性增加。有研究表明，OSA患者外周壓力感受器的敏感程度與OSA的嚴重程度密切相關，表明IH能夠同時刺激化學感受器興奮和影響壓力感受器的功能，從而共同參與睡眠期間交感神經的過度激活。交感神經活性過度增強，會導致外周脈管系統的血管收縮，從而引起血壓上升，這些由于交感神經活性過度增強機體應激產生的反應會更進一步使血壓升高。

內源性HS由L-cys通過以下3種關鍵酶合成，分別是：CBS、CSE和3-巰基丙酮酸硫轉移酶(3-mercaptopyruvate sulfurtransferase，3-MST)。HS 在舒張血管、抑制血管重構和保護心肌等方面具有重要的生理作用，并且與多種心血管疾病相關。L-cys在體內有許多代謝途徑：不但可以通過氧化還原途徑分解為半胱亞磺酸，隨后半胱亞磺酸在酶的作用下代謝為牛磺酸(Tau)和CO或丙酮酸鹽和無機硫(HS)；也可發生脫硫反應，產生丙酮酸鹽和過硫化物。除了形成代謝物Tau外，所有L-cys分解代謝的路徑中L-cys的碳鏈轉化為丙酮酸，巰基轉化為無機硫(HS)。前期實驗表明IH可引起大鼠血漿中HS含量降低，口服L-cys可顯著抑制IH引起的血壓升高和交感神經過度激活，提示L-cys可增加大鼠體內HS的含量，而HS可以降低交感神經的過度激活，從而降低IH所致大鼠的高血壓。

本研究的創新之處通過建立間歇性低氧動物模型，將整體和分子水平的研究有機的結合起來，綜合應用心血管生理學、藥理學、組織化學、分子生物學等多種技術方法解決問題。本研究的局限之處在于沒有開展細胞方面的實驗與動物實驗相互驗證。預計下一步通過細胞實驗與動物實驗相結合來驗證L-cys增加內源性HS對間歇性低氧引起的大鼠高血壓的影響及機制。