抑制PCSK9對人主動脈內皮細胞鈣化的保護作用

靳天慧，陳 亮,2，劉葉紅，盛 瑛,2，宗剛軍,2

血管鈣化在動脈粥樣硬化性心腦血管疾病以及腎功能衰竭的患者中非常普遍。內皮細胞和血管平滑肌細胞的衰老，細胞外基質沉積以及血管周圍脂肪組織的炎癥反應等機制都參與了血管鈣化的發生和發展。前蛋白轉化酶枯草溶菌素9(proprotein convertase subtilisin kexin type 9，PCSK9)由參與動脈粥樣硬化的多種細胞(如內皮細胞、平滑肌細胞和巨噬細胞)表達，并在人的動脈粥樣硬化斑塊內被檢測到。PCSK9通過激活巨噬細胞，釋放促炎細胞因子，來調節炎癥，這是鈣化的關鍵因素。單次注射獲得功能突變的PCSK9腺相關病毒載體，可在沒有基因修飾的小鼠中誘發心血管鈣化。因此，PCSK9有可能成為新的預防和治療血管鈣化性疾病方法的潛在分子靶點。該研究旨在探討抑制PCSK9對人主動脈內皮細胞(human aortic endothelial cells，HAEC)鈣化的保護作用。

1 材料與方法

1.1 材料

HAEC購于美國ATCC細胞庫。DMEM高糖培養基、胎牛血清購于美國Gibco公司；胰酶細胞消化液、Western及IP細胞裂解液購于上海碧云天生物技術有限公司；RNA快速提取試劑盒購于上海奕彬生物科技有限公司。一抗骨形態發生蛋白(bone morphogenetic protein，BMP)2、BMP4購于美國Abcam公司；一抗PCSK9購于美國Abways公司；LipofectamineTM 3000 購于美國ThermoFisher公司；引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成；小干擾RNA si-PCSK9購于北京擎科生物科技有限公司；HiScript Reverse Transcriptase、ChamQ SYBR qPCR Master Mix購于南京諾唯贊生物科技有限公司。

1.2 方法

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細胞培養與分組 HAEC在含有10%胎牛血清+1%雙抗(青霉素和鏈霉素)的DMEM高糖培養基中培養，置于5% CO、37 ℃培養箱中。① 磷酸鹽在血管鈣化中起著核心作用，分別使用(0、10、30、50 mmol/L)β甘油磷酸+50 μg/ml L-抗壞血酸+100 nmol/L 地塞米松刺激HAEC 10 d，篩選出誘導細胞鈣化的最佳濃度并檢測PCSK9的表達。② 將生長狀態良好的HAEC接種至12孔板，隨機分為陰性對照組(siNC)及PCSK9抑制組(siPCSK9-1、siPCSK9-2、siPCSK9-3)，待細胞密度達到90%，用LipofectamineTM 3000進行siRNA轉染，48 h后驗證轉染效率。③將對數生長期HAEC接種于12孔板，隨機分為對照、鈣化、鈣化+siNC、鈣化+siPCSK9組。待細胞匯合度大于70%，鈣化+siNC組、鈣化+siPCSK9組用LipofectamineTM 3000進行siRNA轉染，48 h后鈣化、鈣化+siNC、鈣化+siPCSK9組用30 mmol/L β甘油磷酸+50 μg/ml L-抗壞血酸+100 nmol/L地塞米松誘導HAEC鈣化。

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qRT-PCR檢測BMP2、BMP4、RUNX2、PCSK9的mRNA表達情況 采用RNA快速提取試劑盒提取總RNA，用分光光度計檢測RNA純度和濃度。使用諾唯贊逆轉錄試劑將總RNA反轉錄為cDNA。按照SYBR說明進行引物擴增。引物序列見表1。

表1 qRT-PCR目的基因的引物及siRNA的序列

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Western blot法檢測BMP2、BMP4、PCSK9的蛋白表達情況 用細胞裂解液提取總蛋白。通過12%的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離等量的蛋白質，并將其轉移到PVDF膜上。用5%BSA在搖床上封閉1h，一抗在4°C下孵育過夜。用TBST洗滌3次后，將PVDF膜與相應的二抗室溫孵育1h。再次用TBST洗滌3次，使用發光液分析條帶強度。

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茜素紅S染色觀察細胞內的鈣化沉積 去除培養液后，用PBS溶液洗細胞。將細胞在4%多聚甲醛中室溫固定30 min。隨后，用PBS洗滌細胞3次，每次5 min。加入茜素紅S染液(1%，pH 4.2)浸染8 min，用PBS快速沖洗，顯微鏡下觀察鈣化沉積。

2 結果

2.1 篩選誘導HAEC鈣化的最佳濃度

使用地塞米松聯合L-抗壞血酸和β甘油磷酸的方法誘導HAEC鈣化，保持地塞米松(100 nmol/L)和L-抗壞血酸(50 μg/ml)濃度不變，分別加入0、10、30、50 mmol/L的β甘油磷酸處理細胞。qRT-PCR結果顯示，誘導HAEC鈣化10 d后，β甘油磷酸濃度為30 mmol/L時，主要鈣化指標BMP2(

t

=-12.83，

P

<0.001)、BMP4(

t

=-4.54，

P

<0.05)、RUNX2(

t

=-5.60，

P

<0.05)的基因表達水平明顯高于0 mmol/L，見圖1。Western blot結果顯示，當β甘油磷酸濃度為30 mmol/L時，BMP2、BMP4的蛋白水平升高最明顯，見圖2。因此選取濃度為30 mmol/L的β甘油磷酸進行后續實驗。

圖1 qRT-PCR檢測不同濃度β甘油磷酸處理后HAEC的BMP2、BMP4、RUNX2基因表達水平與0 mmol/L比較：*P<0.05

圖2 Western blot 檢測不同濃度β甘油磷酸處理后HAEC的BMP2、BMP4蛋白表達水平

2.2 HAEC鈣化時PCSK9的表達水平升高

選用β甘油磷酸(30 mmol/L)聯合地塞米松(100 nmol/L)和L-抗壞血酸(50 μg/ml)誘導HAEC鈣化，10 d后收取細胞，設置為鈣化組。同期以PBS處理的細胞為對照組。qRT-PCR結果提示在誘導HAEC發生鈣化后，細胞內PCSK9的mRNA表達水平增加(2.35±1.39)倍(

t

=-3.16，

P

<0.05)。此外，Western blot結果也顯示，在體外誘導HAEC鈣化后，細胞內PCSK9的蛋白表達水平也明顯高于對照組，見圖3。

2.3 小干擾RNA(siRNA)對HAEC中PCSK9的敲低驗證

根據不同設計序列分別采用3種siRNA轉染HAEC，提取RNA并反轉錄后采用qRT-PCR檢測細胞內PCSK9的表達。結果顯示，siPCSK9-2對HAEC中PCSK9表達的抑制作用最為明顯，較陰性對照組下調(48.36±14.41)%，抑制效果最佳(

t

=4.32，

P

<0.05)，見圖4。Western blot結果顯示，轉染3種siRNA后，siPCSK9-2的蛋白表達水平明顯低于陰性對照組，見圖5。因此選取siPCSK9-2作為敲低PCSK9的工具進行后續試驗。

圖3 qRT-PCR與Western blot檢測HAEC的PCSK9基因和蛋白表達水平

圖4 qRT-PCR檢測HAEC的PCSK9基因表達水平 與陰性對照組比較：*P<0.05

圖5 Western blot 檢測HAEC的PCSK9蛋白表達水平

2.4 抑制PCSK9對HAEC鈣化的影響

采用siPCSK9-2轉染細胞后，以同樣的方法誘導HAEC鈣化，觀察PCSK9敲低后對HAEC鈣化的影響。qRT-PCR結果顯示，在相同鈣化誘導條件下，敲低PCSK9(鈣化+siPCSK9組)抑制了細胞內BMP2(

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=10.45，

P

<0.001)、RUNX2(

t

=10.78，

P

<0.001)的基因表達水平(與鈣化組相比)，見圖6。進一步通過Western blot檢測細胞內主要鈣化指標的蛋白表達水平，結果顯示在同等誘導鈣化的條件下，敲低PCSK9抑制了細胞內BMP2、BMP4的蛋白表達水平，見圖7。茜素紅S染色觀察細胞內鈣鹽沉積的形態學改變，結果顯示敲低PCSK9后細胞內的鈣鹽沉積較正常鈣化組減少，見圖8。

圖6 qRT-PCR檢測HAEC的BMP2、Runx2基因表達水平

圖7 Western blot檢測HAEC的BMP2、BMP4蛋白表達水平

圖8 茜素紅S染色檢測HAEC的鈣化沉積 ×200

3 討論

血管鈣化是血管疾病的常見和嚴重并發癥，其增加了糖尿病和動脈粥樣硬化的發病率和病死率，并與充血性心力衰竭、心肌梗死、全身性高血壓和慢性腎臟疾病的風險增加有關。以前被認為是不受控制的礦物質沉淀的最終過程，現在確定它是一種多方面的疾病，受其血管位置，鈣化細胞起源和許多調節途徑的特性影響。起初，由于鈣化主要見于中膜，所有焦點都集中在內側細胞，包括血管平滑肌細胞和周細胞。然后病灶擴大，包括所有血管層的細胞，包括外膜和內皮。內皮在維持血管穩態方面起著重要作用，并參與許多生理功能，包括調節血壓，促進血管生成和控制凝血過程。內皮細胞通過內皮間質轉化有助于血管鈣化。研究表明100 nmol/L 地塞米松、50 μg/ml L-抗壞血酸和10 mmol/L β甘油磷酸可誘導人血管平滑肌細胞成骨分化。高濃度的β甘油磷酸、地塞米松和L-抗壞血酸可以誘導HAEC鈣化。礦物質穩態的破壞和高磷酸鹽水平被認為是慢性腎臟病中血管鈣化的主要決定因素。即使腎功能正常，血清中磷酸鹽的增加也與心血管病死率和冠狀動脈鈣化有關，提示磷酸鹽在血管鈣化的病理生理中起重要作用。因此，課題組分別用0、10、30、50 mmol/L的β甘油磷酸處理細胞，篩選誘導HAEC鈣化的最佳濃度。

PCSK9是前蛋白轉化酶家族的第9個成員，已成為開發新的降膽固醇藥物和干預動脈粥樣硬化治療的熱門靶點。PCSK9可能通過獨立于低密度脂蛋白受體的機制促進炎癥、內皮功能障礙和高血壓，從而加速動脈粥樣硬化。因此，抑制PCSK9是一種有前途的治療方法。使用PCSK9抑制劑進行治療的目的是降低循環中PCSK9水平。治療方法包括結合循環PCSK9(單克隆抗體和修飾的結合蛋白)或減少該蛋白在肝臟的生成(siRNA)。有研究表明，與對照組相比，鈣化性主動脈瓣狹窄患者主動脈瓣中PCSK9表達較高。用成骨培養基處理人瓣膜間質細胞，PCSK9水平升高，而PCSK9中和抗體減少鈣積累。多廿烷醇可降低循環PCSK9水平，抑制鈣化標志物，并減輕主動脈鈣化，表明多廿烷醇可部分通過抑制PCSK9的表達而發揮抗鈣化作用。除肝臟外，PCSK9在其他組織中也高水平表達，其功能尚不清楚，可能是內皮調節預防或治療血管鈣化的有用靶點。需要進一步的研究來了解PCSK9在血管鈣化的發病機制中的潛在新作用。

本研究采用不同濃度的β甘油磷酸聯合L-抗壞血酸和地塞米松誘導HAEC鈣化，篩選出最適合體外誘導HAEC鈣化的藥物濃度。觀察顯示體外誘導HAEC鈣化時細胞內PCSK9的表達水平升高。進一步通過siRNA敲低細胞內PCSK9的表達，采用同樣方法誘導HAEC鈣化后觀察到，敲低PCSK9抑制了HAEC中主要鈣化指標的表達以及鈣鹽沉積。上述結果提示PCSK9參與了HAEC鈣化的發生發展，可能作為影響血管鈣化的表觀遺傳因子發揮重要的調控作用，對于進一步研究PCSK9調節血管鈣化的分子機制具有重要意義。