新型聚己內酯納米纖維三維支架對牙周組織再生的影響?

吳世卿 溫志欣 何翠媚 劉雄 歐陽嘉杰 廖奕翔

牙周組織再生是口腔臨床治療中面臨的一個重大問題，牙周病引起的牙周軟硬組織缺失、拔牙后牙槽骨高度和寬度的減少及軟組織的萎縮、外科手術導致的軟硬組織缺損等，均給臨床治療帶來種種困難。傳統的牙周組織再生方法有牙周植骨術、引導組織再生術[1]。牙周植骨術是采用骨或骨的替代品等移植材料修復牙槽骨缺損，但植骨材料骨誘導能力低，通常被大量的結締組織覆蓋；而引導組織再生術是利用生物膜作為屏障阻擋牙齦上皮及結締組織長入，引導牙周膜細胞優先長入根面，但無骨細胞誘導能力[2]。因此尋找一種既能誘導軟組織再生，亦能誘導骨組織再生的生物學材料用于調控牙周組織再生重建的過程，具有重要的科學價值與實際意義。前期實驗中自主合成了新型聚己內酯納米纖維三維支架，并與上皮角化細胞、成纖維細胞共培養，發現其具有較好的促進細胞分化和增殖的特性。因此，筆者提出新型聚己內酯納米纖維三維支架能更好地促進人口腔源性成骨細胞和牙周成纖維細胞增殖和分化的假說。筆者擬從動物模型層面上探討新型聚己內酯納米纖維三維支架調控牙周組織再生的作用，為尋找一種既能誘導軟組織再生，亦能誘導骨組織再生的生物學材料提供新線索，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 一般材料

1.1.1 實驗動物和試劑 選取清潔級的SD大鼠24只，8周齡，體重200～250 g，雄性，購自廣東省實驗醫學動物中心[SYXK（粵）2016-0073]，籠內飼養，正常光照，保證相對的溫度和濕度，在動物實驗的過程中嚴格貫徹3R原則。DMEM培養液（美國Gibco公司）；胎牛血清（美國Sigma）；逆轉錄試劑盒（美國Thereto）；0.25%胰蛋白酶（江蘇碧云天生物技術研究所）；BCA蛋白測定試劑盒（南京建成生物工程研究所）；蘇木素、伊紅（上海申能博彩生物技術公司）；聚己內酯（美國Sigma）；甲基潑尼松龍（上海國藥集團化學試劑有限公司）。

1.1.2 實驗分組和建模 將24只大鼠隨機分為三組，每組8只大鼠，空白對照組（不植入任何材料）、陰性對照組（植入膠原凝膠）和實驗組（植入新型聚己內酯納米纖維三維支架），經腹部注射10%的20 mg/kg的水合氯醛麻醉大鼠，參照Botelho等[3]的研究方法建立大鼠牙周炎模型，大鼠仰臥在實驗臺上，使上頜磨牙充分暴露，分離牙齦到骨面，在上頜第一顆和第二顆磨牙之間置放結扎絲，確保結扎絲無松脫，結扎完成，建立大鼠牙周炎模型后，陰性對照組植入膠原凝膠，實驗組植入新型聚己內酯納米纖維三維支架，空白對照組不做任何處理，并檢查結扎線是否松動脫線，持續到術后14 d。

1.2 方法

1.2.1 micro-CT定量分析 術后2周，經腹部注射10%水合氯醛麻醉大鼠，采用4%的多聚甲醛對心臟進行灌流固定，取雙側上頜骨后，從腭中縫處分為左右兩個磨牙段及牙周組織聯合標本，放于4%的多聚甲醛中固定。在將標本浸沒在含有乙醇溶液的掃描管中，采用micro-CT掃描上頜第一顆和第二顆磨牙之間的牙槽區域，并使用計算機軟件分析相關參數骨礦物質密度（BMD）、組織礦物質密度（TMD）、骨體積分數（BV/TV）、骨小梁數目（Tb.N）、骨小梁分離度（Tb.Sp）和骨小梁厚度（Tb.Th）。

1.2.2 HE染色 將所取兩個磨牙段及牙周組織聯合標本放入4%的多聚甲醛固定，酒精脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，切片后進行蘇木素-伊紅（HE）染色，首先放于60 ℃烤箱進行20 min烤片，脫蠟，蘇木素染3 min，自來水沖洗3次，伊紅染1 min，自來水沖洗2次，封片，顯微鏡下觀察小鼠所取組織的病理學變化。

1.2.3 組織病理評分 采用0～3分等級對第一和第二磨牙之間的牙周組織的淋巴細胞、中性粒細胞和單核巨噬細胞等炎癥細胞進行評價。0分為未見牙槽骨和牙骨質吸收，少量或者炎性細胞浸潤；1分為牙槽骨輕度吸收，牙骨質完整，炎癥細胞出現中等性浸潤；2分為牙槽骨吸收破壞明顯，牙骨質出現少量破壞，炎性細胞大量浸潤；3分為牙槽骨吸收嚴重，牙骨質出現嚴重的破壞，上皮全層出現大量的炎癥細胞。

1.2.4 Western blot檢測 采用RIPA裂解緩沖液對蛋白進行提取，采用BCA蛋白檢測試劑盒檢測蛋白濃度，SDS-PAGE電泳，轉膜，然后用5%脫脂乳封閉膜，在4 ℃下，添加一抗體孵育過夜，一抗IL-6（1∶1 000）、IL-1b（1∶1 000）、MCP-1（1∶1 000）進行稀釋，然后在室溫下用二抗孵育2 h，最后，采用增強化學發光（ECL）試劑，β-actin作內參，檢測IL-6、IL-1b、G-CSF、MCP-1蛋白表達。

1.2.5 qRT-PCR檢測 采用Trizol法提取總RNA，反轉錄成cDNA，按照試劑說明進行實驗，用DNA熒光染料SYBR GreenⅠ對Runx-2、RANK、OPG和Collagen-Ⅰ水平進行檢測，Runx-2 mRNA上游5’-GGTGAGAAACCCACCACAT-3’，下游5’-GGTGCTGATGTACCAGTT-3’；RANK mRNA上游5’-GGTGAGAAACCCACCACAT-3’，下游5’-GGTGCTGATGTACCAGTT-3’；OPGmRNA上游5’-GGACTACAGATGCACCACCATTA-3’，下游5’-TGAGCACTGTGTCCATAG -3’；Collagen-Ⅰ mRNA上游5’-CCATGUAUGUAACACGGUCC-3’，下游5’-CACAAGACAATTAGG-3’；β-actin作為內參，引物序列為上游5’-AACCATCTATCCCATCATC-3’，下游5’-GCACAGTCCATAGCCTTACGAA-3’，反應條件為 92 ℃，30 min；86 ℃、69 ℃，各20 s；75 ℃，10 min；循環次數為 40次，用相對定量2-ΔΔCT計算Runx-2、RANK、OPG、Collagen-ⅠmRNA水平，并計算RANK/OPG mRNA。

1.3 統計學處理

本研究數據采用SPSS 19.0統計學軟件進行分析和處理，計量資料以（±s）表示，采用t檢驗，多組資料間比較采用SNK-q檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 三組牙周骨組織再生指標對比

micro-CT定量分析，陰性對照組和實驗組BMD、TMD、BV/TV、Tb.N、Tb.Th均明顯高于空白對照組（P<0.05），且實驗組BMD、TMD、BV/TV、Tb.N、Tb.Th均明顯高于陰性對照組（P<0.05）；陰性對照組和實驗組Tb.Sp明顯低于空白對照組（P<0.05），且實驗組Tb.Sp明顯低于陰性對照組（P<0.05），見表 1。

表1 三組牙周骨組織再生指標對比 （±s）

表1 三組牙周骨組織再生指標對比 （±s）

組別 BMD（mm3） TMD（mm3） BV/TV（%） Tb.N（mm-1） Tb.Sp（mm） Tb.Th（mm）空白對照組（n=8） 803.46±56.59 149.76±52.51 0.09±0.02 4.98±0.13 0.26±0.06 0.07±0.02陰性對照組（n=8） 827.63±49.62 306.79±71.19 0.28±0.11 7.28±1.17 0.21±0.04 0.12±0.05實驗組（n=8） 851.27±62.53 357.41±76.37 0.35±0.14 9.04±1.89 0.13±0.01 0.16±0.02 F值 21.693 49.561 5.878 7.927 4.964 4.129 P值 <0.001 <0.001 0.002 0.001 0.005 0.007

2.2 HE染色觀察牙周組織病理學觀察

組織病理學評分結果顯示，空白對照組、陰性對照組和實驗組的組織病理學評分分別為（2.72±0.91）、（2.69±0.89）、（2.67±0.90）分，三組組織學評分比較差異無統計學意義（P=0.087），見圖 1。

圖1 HE染色結果 （×200）

2.3 三組炎癥相關蛋白表達比較

Western blot實驗結果顯示，三組炎癥相關蛋白IL-6、IL-1b和MCP-1水平比較差異無統計學意義（P>0.05），見表2、圖2。

表2 三組炎癥相關蛋白表達比較 （±s）

表2 三組炎癥相關蛋白表達比較 （±s）

組別 IL-6 IL-1b MCP-1空白對照組（n=8） 0.36±0.02 1.03±0.04 1.27±0.05陰性對照組（n=8） 0.34±0.01 1.05±0.03 1.23±0.06實驗組（n=8） 0.35±0.02 1.02±0.02 1.19±0.07 F值 2.773 1.984 2.543 P值 0.098 0.217 0.086

圖2 三組炎癥相關蛋白表達

2.4 三組骨及牙周膜改建相關因子表達比較

qRT-PCR檢測結果顯示，陰性對照組和實驗組Runx-2mRNA、RANK/OPG mRNA比 值、Collagen-ⅠmRNA相 對表達均明顯高于空白對照組（P<0.05），且實驗組Runx-2、RANK/OPG mRNA、Collagen-Ⅰ mRNA的相對表達明顯高于陰性對照組，差異有統計學意義（P<0.05），見表3。

表3 三組骨及牙周膜改建相關因子表達比較 （±s）

表3 三組骨及牙周膜改建相關因子表達比較 （±s）

組別 Runx-2 mRNA RANK/OPG mRNA Collagen-Ⅰ mRNA空白對照組（n=8） 1.82±0.07 4.92±0.39 1.06±0.03陰性對照組（n=8） 2.29±0.11 7.31±0.48 2.03±0.07實驗組（n=8） 3.02±0.19 16.63±1.26 2.84±0.51 F值 5.579 12.539 4.492 P值 0.003 <0.001 0.008

3 討論

牙周病一般是指牙周膜、牙槽骨和牙骨質相關的支持組織發生慢性的破壞，該病已經成為牙齒缺失的主要原因[4]。到目前為止，牙周組織再生修復仍舊是國內外口腔醫學研究的熱點問題?？谇环N植術是常用的修復缺失牙手段，但由于在治療過程中會使牙槽骨產生功能性刺激喪失，進而導致軟組織的萎縮和牙槽骨高度和寬度的降低，增加了種植牙植入的難度[5]。種植區軟硬組織的形態和質量是影響種植體三維植入位點的遠期存留的主要因素[6]。目前對于這些既有軟組織缺損又有硬組織缺損的病例治療中需同時植入軟組織移植骨替代材料，缺一不可。因此如能尋找一種既能引導軟組織再生、亦能引導骨組織及血管再生的生物學材料用于調控牙周組織再生重建的過程，對滿足口腔醫學臨床的應用需求將具有重要的科學價值與實際意義。

靜電紡絲技術是一種獨特的納米纖維制造技術[7]，已經在骨再生、血管再生、周圍神經再生、皮膚再生等諸多組織再生領域獲得了突破和進展，并被認為是最有希望在組織再生領域取得重大成果的技術[8]。筆者前期研究的新型聚己內酯納米纖維三維支架，其是一種使用最先進的電紡技術制作、具有梯度納米結構的生物技術制作支架材料，不僅具備靜電紡絲技術的優點，還具有獨特的創新之處[9]。首先，梯度納米明膠纖維結構更有利于細胞的種植、黏附和分化；其次，聚己內酯納米纖維三維技術增加了支架的生物相容性、耐水性和穩定性[10]。相關研究已將牙齦角化細胞、牙齦成纖維細胞接種到新型聚己內酯納米纖維三維支架上，發現細胞層數最高可達9～10層，而對照組接種到膠原凝膠上的牙齦角化細胞和牙齦成纖維細胞最多形成3層細胞，顯示出新型聚己內酯納米纖維三維支架有較好的促進細胞分化和增殖的特性[11-13]。也有研究將新型聚己內酯納米纖維三維支架植入中節段性骨缺損處，結果發現缺損處軟組織再生[14-15]。借助以上思路，筆者建立了動物模型，進一步研究新型聚己內酯納米纖維三維支架促牙周組織再生的作用，為臨床上尋找一種能同時引導軟硬組織再生的生物學材料提供理論基礎依據。

本研究結果顯示，實驗組BMD、TMD、BV/TV、Tb.N、Tb.Th顯著高于陰性對照組及空白對照組；實驗組Tb.Sp顯著低于陰性對照組及空白對照組。三組組織學評分比較差異無統計學意義（P>0.05）；三組炎癥相關蛋白IL-6、IL-1b、MCP-1水平比較差異無統計學意義（P>0.05）；實驗組Runx-2 mRNA、RANK/OPG mRNA、Collagen-Ⅰ mRNA的相對表達高于陰性對照組及空白對照組。提示新型聚己內酯納米纖維三維支架抑制炎癥因子的效果并不明顯，而對于骨組織再生和牙周膜改建具有一定的促進作用。

綜上所述，新型聚己內酯納米纖維三維支架能促進牙齦組織、牙周膜組織、骨組織再生，彌補臨床上生物膜僅能促進骨組織再生或僅能促進軟組織再生功能單一性的缺陷，對滿足口腔醫學臨床的應用需求將具有重要的科學價值與實際意義。