補腎調經方激活ERK信號通路抑制內質網應激促進血管生成的研究*

河北中醫學院 河北省中西醫結合肝腎病證研究重點實驗室

曹 璨 周玉玲 杜澍金 賀 明 范麗潔 何 蓮 張 宇(石家莊 050200)

提要 目的：研究補腎調經方對子宮內膜微血管內皮細胞內質網應激(ERS)狀態的影響，探討其促進子宮內膜血管生成改善子宮內膜容受性的作用。方法：將人子宮內膜微血管內皮細胞(HEMECs)分為對照組、雌激素(E2)組、補腎組和E2+補腎組，Western blot和實時熒光定量聚合酶鏈式反應(RT-PCR)檢測細胞中葡萄糖調節蛋白78(GRP78)的蛋白和mRNA表達變化；Western blot方法檢測細胞外信號調節蛋白激酶(ERK)以及磷酸化細胞外信號調節激酶(p-ERK)的表達變化。結果：在給予補腎調經方預孵育后，GRP78的蛋白和mRNA水平均降低(P<0.05)，p-ERK的蛋白水平升高(P<0.05)；在給予ERK信號通路抑制劑后，GRP78的蛋白和mRNA水平升高(P<0.05)。結論：補腎調經方通過激活ERK通路抑制ERS以促進子宮內膜血管生成。

子宮內膜容受性是保證胚胎成功著床的關鍵因素。在眾多評價子宮內膜容受性的條件中，血管生成尤為重要，良好的血供保證胚胎正常著床；而內質網應激(ERS)是導致血管損傷的因素，研究證實，雌激素(E2)可以改善ERS造成的血管內皮細胞損傷并促血管生成[1]。在胚胎著床階段，E2具有促進胚胎滋養層細胞生長和血管生成的作用[2]。因此，臨床上外源性給予E2可以用于改善子宮內膜的厚度不佳導致的子宮內膜容受性低下。

中醫認為，腎主生殖，腎精充盛，胞宮得以滋養，才能保證胚胎的生長發育。因此補腎法在臨床上多用于治療子宮內膜容受性低下引起的不孕[3]，且本課題組大量的前期實驗已經表明補腎法可以促進子宮內膜血管生成以改善子宮內膜容受性，但補腎法是否通過影響ERS促進血管生成有待于進一步研究。

1 材料

1.1 細胞 人子宮內膜微血管內皮細胞(HEMECs)購自ScienCell公司。

1.2 藥物 補腎法的代表方補腎調經方組成：熟地黃20 g，當歸10 g，山茱萸15 g，山藥12 g，丹參、覆盆子、淫羊藿、紫河車各10 g，枸杞子、菟絲子各12 g，白芍、女貞子各9 g，香附6 g。藥物均購于樂仁堂藥房，制成精致混懸液，生藥濃度為1.5 g/mL，4 ℃冰箱保存。

1.3 主要試劑和儀器 GRP78抗體(ab21685, abcam)；ERK抗體(16443-1-AP, Proteintech)；p-ERK抗體(YP0101, Immunoway)；GAPDH抗體(10494-1-AP, Proteintech)；HRP鼠二抗(sc-516102, Santa Cruz)；Total RNA Kit Ⅱ(R6934-01, OMEGA)；M-MLV逆轉錄試劑盒(R021-01, Vazyme)；SYBR Green Ⅰ熒光定量聚合酶鏈式反應(PCR)試劑盒(Q311-02, Vazyme)；引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。

實時熒光定量PCR儀(7500 Fast，美國賽默飛公司)；分光光度計(NanoDrop 2000，美國賽默飛公司)；激光共聚焦顯微鏡(SP8，德國萊卡公司)；化學發光系統(LAS4000，美國GE公司)；半干轉膜儀(Trans-Blot SD，美國伯樂公司)。

2 方法

2.1 細胞分組與處理 HEMECs用含10%胎牛血清(FBS)ECM培養基在37 ℃、5% CO2培養箱培養，隔天換液，待HEMECs密度約為90%左右時用0.25%胰酶(含EDTA)消化傳代，傳3代后用于實驗。待細胞長至80%，給予雌激素(E2)或補腎含藥血清刺激12 h，收細胞用于后續實驗。實驗分組：對照組、E2組、補腎組、E2+補腎組。

2.2 Western blot分析 用RIPA裂解液裂解HEMECs，從HEMECs分離的蛋白在10%SDS-PAGE凝膠上電泳，并轉移到PVDF膜上。將膜用8%的TTBS牛奶在37 ℃環境下封閉2 h，并在4 ℃與以下一抗孵育過夜：葡萄糖調節蛋白78(GRP78)，磷酸化細胞外信號調節激酶(p-ERK)，細胞外信號調節蛋白激酶(ERK)，甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)。TTBS洗滌膜后，在室溫下與相應的HRP標記的二抗(1∶1 000)孵育1 h。使用化學發光儀對抗體-抗原復合物進行成像。

2.3 實時熒光定量PCR 采用Total RNA Kit Ⅱ試劑盒從HEMECs中提取總RNA，使用分光光度計檢測RNA總濃度。逆轉錄反應及實時熒光定量RT-PCR檢測按照試劑盒說明書進行。所用引物序列如表1。

表1 所用引物序列

3 結果

3.1 HEMECs各組GRP78蛋白和mRNA水平比較 Western blot分析結果顯示，E2組、補腎組以及E2+補腎組中GRP78的表達與對照組相比明顯降低(P<0.05)。GRP78的mRNA變化與蛋白表達一致，與對照組相比，E2組、補腎組和 E2+補腎組中明顯降低(P<0.05)。見圖1。

注：A. Western blot條帶結果； B. GRP78蛋白表達灰度值； C. GRP78 mRNA表達水平。與對照組(Con)相比，*P<0.05。

3.2 HEMECs各組ERK信號通路的變化 檢測HEMECs各組p-ERK和ERK的蛋白表達，補腎組和 E2+補腎組中p-ERK的表達與對照組相比明顯升高(P<0.05)，差異具有顯著性，E2+補腎組的p-ERK的蛋白表達最高。ERK表達與正常組相比差異無顯著性。見圖2。

注：A. Western blot條帶結果； B. p-ERK蛋白表達灰度值。與對照組(Con)相比，*P<0.05。

3.3 添加ERK信號通路抑制劑后HEMECs各組GRP78表達變化 為證實ERK信號通路與ERS之間的關系，筆者采用ERK抑制劑PD98059抑制該信號通路，觀察GRP78的變化。Western blot分析結果發現：與對照組相比，補腎組和E2+補腎組的GRP78的蛋白表達降低(P<0.05)，而E2+補腎組+PD98059組與E2+補腎組相比，GRP78的蛋白表達明顯升高(P<0.05)，差異具有顯著性。RT-PCR結果與Western blot分析結果相一致：補腎組和E2+補腎組的GRP78的mRNA水平明顯要低于對照組(P<0.05)，E2+補腎組+PD98059組的GRP78的mRNA水平明顯高于E2+補腎組(P<0.05)。結果表明：在HEMECs中，補腎調經方通過激活ERK信號通路抑制GRP78的蛋白和mRNA水平。見圖3。

注：A. Western blot條帶結果；B. GRP78蛋白表達灰度值；C. GRP78 mRNA表達水平。與對照組(Con)相比，*P<0.05；與E2+補腎+PD98059組相比，# P<0.05 。

4 討論

子宮內膜作為母胎界面主要的構架，與胚胎植入著床息息相關。在現代醫學中，輔助生殖技術得以迅速發展，這使得胚胎的植入率得以提高，但是妊娠率仍不理想，子宮內膜容受性低下是其中的關鍵。臨床上多采用E2以改善子宮內膜容受性的不良狀態，本課題組猜測這可能與E2改善血管生成，提供充分的養料有關，但其中的機制尚未明確。

ERS是一種大量錯誤折疊蛋白在內質網聚積引起的應激反應，會在氧化應激、缺血等情況下發生而影響血管內皮細胞的功能進而導致血管損傷[4]。生理狀態下，內質網膜上的跨膜蛋白可以與GRP78結合形成穩定復合物，并處于失活狀態，以維持內質網穩態。但當內質網內部錯誤蛋白大量折疊累積達到內質網承受閾值時，細胞會啟動未折疊蛋白反應的信號轉導途徑(UPR)試圖糾正這種行為，以促進蛋白質的正確折疊，進行內質網的自我修復[5]。

E2可以逆轉由葡萄糖引起的氧化應激而導致的ERS，這可能與其抗氧化活性相關。E2可以通過細胞核內核外效應，減弱未折疊蛋白反應，降低GRP78和磷酸化JNK的表達[6]。GRP78是一種分子伴侶，可以與相關跨膜蛋白結合而抑制其活性，在ERS發生時，GRP78則會與未折疊蛋白結合激活相關通路。所以，GRP78在一定意義上是響應ERS的重要因子。本實驗證明，在子宮內膜微血管內皮細胞中，E2可以抑制GRP78的蛋白表達和mRNA水平，進而改善子宮內膜微血管內皮細胞中的ERS狀態。

ERK信號通路在子宮內膜容受性中具有重要的作用[7-9]，研究發現，細胞外骨架蛋白Talin1可以通過促進VTN/ITGAV-復合物的形成和激活下游的FAK/Src/ERK信號通路來增強子宮內膜上皮細胞的粘附能力，提高子宮內膜容受性[10]。Xie等人[11]發現在給予p38、ERK1/2和AKT的抑制劑后，發現FOXM1的表達水平降低，OPN能夠調節FOXM1的表達通過激活p38、ERK1/2和AKT通路促進HEC-1A細胞的增殖，以此改善子宮內膜容受性。雌激素促進血管生成可能與快速激活了雌激素受體α(ERα)有關，ERα與下游ERK相互作用[12]。本研究發現，E2是通過參與ERK通路來進行對ERS的調節的。

《素問·六節臟象論》中提及“腎者主蟄，封藏之本，精之處也”，腎藏精，主生殖，腎氣充盛，腎精充沛，才能固攝沖任，使胞宮血供豐沛，為子宮內膜的發育生長提供良好的環境，以保證胚胎的著床成功。補腎調經方是由歸腎丸合養精種玉湯加減而成，作為補腎法的代表方在調節女性生殖疾病中發揮了重要作用。湯鍶鍶等人[13]采用補腎活血法輔助宮腔灌流能夠增加子宮內膜厚度，削弱細胞外基質的沉淀，提高妊娠率。耿丹丹等人[14]發現補腎助孕方能夠改善子宮內膜的形態并提高內膜中胞飲突的數量以改善子宮內膜容受性。薛淼淼等人[15]采用補腎疏肝健脾方，可以提高子宮內膜厚度，改善子宮內膜的血流狀態，子宮灌注上升，提高妊娠率。補腎法能夠有效改善腎虛薄型子宮內膜大鼠內膜腺體的數量及形態，促進內膜相關因子的分泌以及雌、孕激素在內膜中的表達[16]；補腎法還可以促進血管生成因子VEGF的表達，增加血管通透能力，促進子宮內膜微血管生成，改善子宮內膜容受狀態[14]。本課題組的前期研究結果也已證明補腎法可通過調節小鼠子宮內膜GRP78的表達水平，改善ERS狀態，提高子宮內膜容受能力[17]。本研究從細胞水平進一步闡明，補腎法的代表方補腎調經方可以顯著降低子宮內膜微血管內皮細胞GRP78的表達水平，改善子宮內膜的ERS狀態，促進子宮內膜血管生成，改善子宮內膜容受性；另一方面，補腎調經方可以激活ERK信號通路，抑制GRP78的表達，促進血管生成。本研究在前期研究基礎上深入探討了補腎法促進血管生成改善子宮內膜容受性的作用機制，對于豐富“腎主生殖”理論具有重要的意義。

綜上所述，E2和補腎調經方能夠激活ERK信號傳導通路下調GRP78的表達，抑制ERS狀態，從而促進血管生成，使子宮內膜處于容受狀態，支持胚胎著床。但是補腎法對子宮內膜其他細胞如上皮細胞、基質細胞的影響的分子機制，還有待于進一步研究。