不同原料等級(jí)黃茶特征香氣成分分析

蔣容港，黃 燕，金友蘭，黃芳芳，劉仲華,4，黃建安，李 勤,4,*

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué) 茶學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長(zhǎng)沙 410128；2.國(guó)家植物功能成分利用工程技術(shù)研究中心，湖南 長(zhǎng)沙 410128；3.益陽(yáng)茶廠有限公司，湖南 益陽(yáng) 413046；4.植物功能成分利用省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心，湖南 長(zhǎng)沙 410128）

黃茶作為我國(guó)六大茶類(lèi)之一，也是我國(guó)獨(dú)有的茶類(lèi)[1]。根據(jù)鮮葉原料不同，主要分為芽型、芽葉型、多葉型3 種類(lèi)型黃茶[2]。黃茶主要加工工序?yàn)闅⑶唷鷲烖S→干燥。悶黃是形成黃茶特有的“三黃”品質(zhì)（干茶黃、湯色黃、葉底黃）的關(guān)鍵工序。在悶黃過(guò)程中，糖類(lèi)物質(zhì)在濕熱作用下會(huì)與氨基酸、多酚類(lèi)化合物發(fā)生反應(yīng)，形成近似“甜香”的品質(zhì)特征[3]，在黃茶干燥過(guò)程中，由于熱的作用，亦形成多種復(fù)雜芳香物質(zhì)。

茶葉香氣是影響茶葉品質(zhì)的重要因素之一[4]。霍山黃芽的主要香氣成分為脂肪烴和芳香類(lèi)化合物；隨后研究進(jìn)一步探究霍山黃芽與君山銀針的香氣成分，其共有化合物為十三烷、δ-杜松烯、芳樟醇、二氫獼猴桃內(nèi)酯、香葉醇等[5-6]；構(gòu)成霍山黃茶香氣的重要物質(zhì)為糠醛、5-甲基呋喃醛、3-乙基-2,5-二甲基吡嗪、水楊酸甲酯等[7]；此外有相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，在品種、栽培條件和加工工藝相同的條件下，鮮葉質(zhì)量是影響其香氣成分種類(lèi)和含量的主要因子[8]。不同原料等級(jí)加工而成的黃茶，其香氣特征各有特點(diǎn)，但其特征香氣化學(xué)物質(zhì)基礎(chǔ)尚不清楚，嚴(yán)重阻礙了產(chǎn)品的標(biāo)準(zhǔn)化。

本研究選取不同原料等級(jí)黃茶樣品（芽型、芽葉型和多葉型）為研究對(duì)象，采用感官審評(píng)、固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)，研究不同原料等級(jí)黃茶特征香氣成分，以期為黃茶香氣品質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)化提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

樣品購(gòu)于湖南省長(zhǎng)沙市高橋茶葉市場(chǎng)，原料等級(jí)為單芽至一芽多葉，生產(chǎn)時(shí)間為2018年，具體名稱(chēng)和產(chǎn)地如表1所示，9 個(gè)黃茶樣品磨碎后分別過(guò)100 目篩，每個(gè)樣品取3 g混合均勻構(gòu)成QC樣品備用。

表1 黃茶樣品信息Table 1 Information about yellow tea samples tested in this study

癸酸乙酯、正構(gòu)烷烴混標(biāo)（C8～C40） 美國(guó)Sigma-Aldrich試劑公司；無(wú)水乙醇（色譜純）、氯化鈉（分析純） 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取頭、固相微萃取手動(dòng)進(jìn)樣手柄 美國(guó)Supelco公司；PC-420D磁力加熱攪拌器北京康林科技有限責(zé)任公司；Simplicity超純水機(jī) 美國(guó)Millipore公司；7890B-7000C氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀 美國(guó)Agilent公司；ATY124電子天平 日本Shimadzu公司。

1.3 方法

1.3.1 黃茶感官審評(píng)

根據(jù)GB/T 23776—2018《茶葉感官審評(píng)方法》對(duì)9 個(gè)茶樣的外形、湯色、香氣、滋味、葉底進(jìn)行特征描述[9]。

1.3.2 頂空固相微萃取條件

內(nèi)標(biāo)溶液配制：取癸酸乙酯標(biāo)準(zhǔn)品母液0.1 mL于100 mL容量瓶中，無(wú)水乙醇定容，配制成質(zhì)量濃度為0.864 g/L標(biāo)準(zhǔn)液，然后稀釋到8.64 mg/L，分裝放置4 ℃下備用。

稱(chēng)取1 g茶葉粉碎樣品置于15 mL頂空瓶，加入轉(zhuǎn)子，稱(chēng)取0.5 g氯化鈉置于10 mL具塞試管中，然后加入5 mL煮沸去離子水，接著再加入10 μL癸酸乙酯（8.64 mg/L），最后倒入裝有茶樣的頂空瓶中，蓋緊瓶蓋，搖勻。將頂空瓶放在磁力加熱攪拌器上，將固相微萃取頭插入頂空瓶頂空部分，平衡10 min后推出纖維頭，纖維頭離液面約1 cm，萃取時(shí)間40 min，萃取溫度80 ℃，轉(zhuǎn)速600 r/min，萃取完成后收回纖維頭，立即插入氣相色譜進(jìn)樣口，于250 ℃解吸5 min。

1.3.3 氣相色譜-質(zhì)譜條件

氣相色譜條件：HP-5MS石英毛細(xì)柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；升溫程序：起始柱溫50 ℃，保持3 min，以3 ℃/min升至170 ℃，然后以5 ℃/min升至190 ℃，最后以15 ℃/min升至250 ℃保持2 min；載氣為高純氦氣（純度≥99.999%）；載氣流速1 mL/min；進(jìn)樣口溫度250 ℃；不分流進(jìn)樣。

質(zhì)譜條件：電子電離源；離子源溫度230 ℃；進(jìn)樣口溫度250 ℃；電子能量70 eV；電子倍增器電壓880 V；采用全掃描模式；質(zhì)量掃描范圍35～400 u。

1.3.4 定性定量分析

定性分析：根據(jù)待測(cè)物質(zhì)的保留時(shí)間，計(jì)算保留指數(shù)（retention index，RI），結(jié)合文獻(xiàn)[10-15]以及數(shù)據(jù)庫(kù)中的RI對(duì)物質(zhì)進(jìn)行鑒定。RI按式（1）計(jì)算[16-18]：

式中：tx為待測(cè)物質(zhì)的保留時(shí)間/min；tn為n個(gè)碳原子數(shù)正構(gòu)烷烴的保留時(shí)間/min；t（n+1）為（n+1）個(gè)碳原子數(shù)正構(gòu)烷烴的保留時(shí)間/min。

定量方法[19]：通過(guò)計(jì)算待測(cè)揮發(fā)物與癸酸乙酯的峰面積之比求其含量（假定各揮發(fā)物的絕對(duì)校正因子為1.0），按式（2）計(jì)算：

1.3.5 香氣活性值（odor active value，OAV）計(jì)算[20]

OAV為某香氣成分的濃度與其嗅覺(jué)閾值的比值，查找相關(guān)文獻(xiàn)[21]獲得閾值，再根據(jù)定量結(jié)果計(jì)算OAV，按式（3）計(jì)算：

式中：Ci為香氣成分的含量/（ng/g）；OTi為該香氣成分的閾值/（μg/kg）。

1.4 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)均進(jìn)行3 次技術(shù)重復(fù)，數(shù)據(jù)均為平均值，數(shù)據(jù)采用SIMCA-P14.0進(jìn)行主成分分析（principal component analysis，PCA）、聚類(lèi)分析（hierarchical cluster analysis，HCA）以及正交偏最小二乘-判別分析（orthogonal partial least squares-discriminant analysis，OPLS-DA），R軟件Pheatmap包進(jìn)行熱圖分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同原料等級(jí)黃茶香氣感官特征

如表2所示，芽型黃茶、芽葉型黃茶和多葉型黃茶均符合黃茶“干茶黃、湯色黃、葉底黃”的典型品質(zhì)特征[22]；其中芽型黃茶香氣屬性以“清香”為主；芽葉型黃茶香氣屬性以“清甜”為主；而多葉型黃茶則呈“鍋巴香”。

表2 不同原料等級(jí)黃茶感官審評(píng)結(jié)果Table 2 Results of sensory evaluation of yellow teas from different grades of raw materials

2.2 不同原料等級(jí)黃茶揮發(fā)性成分

如表3所示，不同原料等級(jí)黃茶中共檢測(cè)到100 種揮發(fā)性成分，包括碳?xì)浠衔?5 種、酯類(lèi)16 種、醇類(lèi)15 種、酮類(lèi)13 種、醛類(lèi)11 種、吡咯類(lèi)及其衍生物7 種、含氮化合物1 種、酸類(lèi)1 種和內(nèi)酯類(lèi)化合物1 種。

表3 黃茶QC樣品揮發(fā)性成分定性結(jié)果Table 3 Qualitative analysis results of volatile components of yellow tea samples

續(xù)表3

續(xù)表3

如表4所示，芽型黃茶樣品揮發(fā)性成分中碳?xì)漕?lèi)化合物和醇類(lèi)含量最高，其次是醛類(lèi)和酯類(lèi)；其中，1-辛烯-3-醇、δ-杜松烯、苯乙醛、芳樟醇、2-氨基-5-甲基苯甲酸和β-紫羅酮是芽型黃茶的主要揮發(fā)性成分。芽葉型黃茶樣品揮發(fā)性成分中醇類(lèi)化合物含量最高，其次是碳?xì)漕?lèi)化合物；其中，香葉醇、芳樟醇、苯乙醇、脫氫芳樟醇、苯甲醇、月桂烯是芽葉型黃茶的主要揮發(fā)性成分。多葉型黃茶揮發(fā)性成分中吡咯類(lèi)及其衍生物顯著高于芽型和芽葉型，其次是碳?xì)漕?lèi)和醇類(lèi)；其中，2,4-二甲基-3-乙基吡咯、3-乙基-2,5-二甲基吡嗪、N-乙基吡咯、2-乙基-5-甲基吡嗪、水楊酸甲酯、3,5-二乙基-2-甲基吡嗪和2,3-二乙基-5-甲基吡嗪是多葉型黃茶的主要揮發(fā)性成分。

表4 3 個(gè)不同原料等級(jí)黃茶的揮發(fā)性成分及其含量Table 4 Relative contents of volatile components in different grades of yellow tea

續(xù)表4

2.3 不同原料等級(jí)黃茶香氣成分

OAV大于1的揮發(fā)性成分被認(rèn)為對(duì)香氣有貢獻(xiàn)[23]。通過(guò)OAV計(jì)算與文獻(xiàn)檢索，共鑒定出55 種OAV大于1的呈香物質(zhì)（表5），包括14 種碳?xì)漕?lèi)化合物、11 種醇類(lèi)化合物、9 種醛類(lèi)化合物、9 種酯類(lèi)化合物、7 種酮類(lèi)化合物、3 種吡咯類(lèi)及其衍生物、1 種酸類(lèi)化合物和1 種內(nèi)酯類(lèi)化合物，這些化合物對(duì)不同原料等級(jí)黃茶的“清香”、“清甜”和“鍋巴香”屬性具有重要貢獻(xiàn)。

表5 不同原料等級(jí)黃茶中關(guān)鍵揮發(fā)性成分的OAV及香氣特征Table 5 OAV values and aroma characteristics of key volatile components in yellow tea from different quality grades

續(xù)表5

芽型黃茶中呈香物質(zhì)有56 種（OAV＞1），其中，OAV大于100的重要香氣成分有4 種，包括清香屬性的苯乙醛，果香屬性的α-紫羅烯，烘烤香屬性的3-乙基-2,5-二甲基吡嗪、2,3-二乙基-5-甲基吡嗪；10＜OAV＜100，呈香物質(zhì)有21 種，包括1-辛烯-3-醇、(E)-3,7-二甲基-1,3,6-辛三烯、(E)-2-辛烯-1-醇、己酸乙酯、芳樟醇等。芽型黃茶呈香物質(zhì)中清香屬性的苯乙醛OAV最大，達(dá)到1 216.98。

芽葉型黃茶中呈香物質(zhì)有61 種（OAV＞1），其中，OAV大于100的重要香氣成分有12 種，包括果香屬性的α-紫羅烯和月桂烯，清香屬性的苯乙醛，甜香屬性的(E)-3,7-二甲基-1,3,6-辛三烯和己酸乙酯，花香屬性的香葉醇、芳樟醇和苯乙醇等；10＜OAV＜100，呈香物

質(zhì)有28 種，包括(E)-2-辛烯-1-醇、苯甲醇、鄰氨基苯甲酸甲酯、β-紫羅酮、丁酸葉醇酯、氧化芳樟醇II、D-檸檬烯、水楊酸甲酯等。其中果香屬性的α-紫羅烯OAV最大，達(dá)到1 103.82。

多葉型黃茶中呈香物質(zhì)有60 種（OAV＞1），其中，OAV大于100的重要香氣成分有14 種，包括烘烤香屬性的2,3-二乙基-5-甲基吡嗪、3-乙基-2,5-二甲基吡嗪、2-乙基-5-甲基吡嗪和N-甲基-2-吡咯甲醛，果香屬性的月桂烯、α-紫羅烯等；10＜OAV＜100，呈香物質(zhì)有芳樟醇、3-異丙基甲苯、β-紫羅酮、苯甲醛、1,2-二氫-1,1,6-三甲基萘、鄰氨基苯甲酸甲酯、苯乙烯、香葉醇等。其中烘烤香屬性的2,3-二乙基-5-甲基吡嗪、3-乙基-2,5-二甲基吡嗪、2-乙基-5-甲基吡嗪、N-甲基-2-吡咯甲醛OAV較大，分別達(dá)到為292 063.89、90 560.30、4 738.83和3 988.36。

2.4 不同原料等級(jí)黃茶特征香氣成分

為了闡明不同原料等級(jí)黃茶特征香氣屬性的差異揮發(fā)性成分，對(duì)所有揮發(fā)性成分進(jìn)行多元統(tǒng)計(jì)分析。本研究中PCA模型共提取10 個(gè)PC，擬合參數(shù)Q2=0.985，表明10 個(gè)PC共提取到揮發(fā)性成分99.7%的信息，同時(shí)模型擬合效果良好。HCA將PCA所提取的10 個(gè)PC全部用于聚類(lèi)，二者分析結(jié)果如圖1所示。圖1A上可明顯分開(kāi)，分別位于3 個(gè)不同的象限，且通過(guò)圖1B可直觀看出3 個(gè)不同原料等級(jí)的黃茶揮發(fā)性成分在組成和含量上存在一定差異。

圖1 不同等級(jí)黃茶揮發(fā)性成分比較分析Fig. 1 Comparative analysis of volatile components in different grades of yellow tea

基于PCA結(jié)果，采用OPLS-DA對(duì)不同等級(jí)黃茶的揮發(fā)性成分進(jìn)行兩兩比較，其中芽型與芽葉型的OPLSDA模型的統(tǒng)計(jì)參數(shù)為和Q2=0.989，芽型與多葉型的OPLS-DA模型的統(tǒng)計(jì)參數(shù)為和Q2=0.992，芽葉型與多葉型的OPLS-DA模型的統(tǒng)計(jì)參數(shù)為和Q2=0.992，各參數(shù)值越接近1，模型的適用性和可預(yù)測(cè)性越好。不同原料等級(jí)黃茶間，共篩選57 個(gè)差異揮發(fā)性成分（變異權(quán)重參數(shù)（variable importance in projection，VIP）＞1，P＜0.05）（表6），包括14 個(gè)碳?xì)漕?lèi)化合物、11 個(gè)醇類(lèi)化合物、9 個(gè)酯類(lèi)化合物、7 個(gè)醛類(lèi)化合物、7 個(gè)吡咯類(lèi)及其衍生物、7 個(gè)酮類(lèi)化合物、1 個(gè)內(nèi)酯類(lèi)化合物和1 個(gè)含氮化合物。

表6 不同原料等級(jí)黃茶差異揮發(fā)性成分香氣屬性Table 6 Differential aroma ingredients of yellow tea from different quality grades of raw materials

續(xù)表6

進(jìn)一步結(jié)合OAV（OAV＞1），篩選了35 種特征香氣成分，包括香葉醇、苯甲醇、芳樟醇、氧化芳樟醇I、氧化芳樟醇II、苯乙醛、N-甲基-2-吡咯甲醛、2,3-二乙基-5-甲基吡嗪、3-乙基-2,5-二甲基吡嗪、2-乙基-5-甲基吡嗪等。如圖2所示，芽型黃茶中具有清香屬性的苯乙醛含量高于其在芽葉和多葉型中的含量，為芽型黃茶的特征香氣成分；芽葉型黃茶中具有甜香與花果香屬性的己酸乙酯、苯甲醇、香葉醇、苯乙醇、檸檬醛、橙花醛和月桂烯的含量顯著高于其在芽型和多葉型中的含量，為芽葉型黃茶的特征香氣成分。多葉型中具有烘烤香屬性的N-甲基-2-吡咯甲醛、3-乙基-2,5-二甲基吡嗪、2-乙基-5-甲基吡嗪和2,3-二乙基-5-甲基吡嗪的含量顯著高于其在芽型和芽葉型中的含量，為多葉型黃茶的特征香氣成分。

圖2 不同原料等級(jí)黃茶關(guān)鍵特征香氣成分熱圖分析Fig. 2 Heatmap analysis of key characteristic aroma components of yellow tea from different quality grades of raw materials

3 討 論

香氣是影響黃茶品質(zhì)的重要因子之一。根據(jù)感官審評(píng)結(jié)果表明不同原料等級(jí)黃茶具有不同的特征香氣屬性，采用固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)從黃茶樣品中分離并鑒定出100 種揮發(fā)性成分，通過(guò)比較發(fā)現(xiàn)不同原料等級(jí)黃茶樣品在揮發(fā)性成分組成和含量上存在較大差異。

不同產(chǎn)地、廠家的黃茶樣品，由于茶樹(shù)品種、生態(tài)環(huán)境、采摘時(shí)間、原料等級(jí)等不同，在加工工藝中悶黃和干燥工藝會(huì)有差別[24-25]，形成豐富多樣的香型[26]；較嫩的原料悶黃時(shí)間較短，且干燥火功會(huì)較輕以保持原料較好的嫩香，而具有一定成熟度的原料悶黃時(shí)間較長(zhǎng)，且在干燥時(shí)一般溫度較高，包括拉毛火和拉老火，拉小火是低溫慢烘至九成干，拉老火則要求火功高，時(shí)間足，充分發(fā)展“火功香”[27]，而且不同烘焙程度對(duì)黃大茶揮發(fā)性品質(zhì)也有影響[28]。

碳?xì)浠衔锸屈S茶中種類(lèi)最豐富的揮發(fā)性成分，其中主要是不飽和烯烴，而不飽和烯烴在其他茶中含量較低，其形成可能與黃茶獨(dú)特的悶黃工序有關(guān)，這與之前廉明等[6]的研究結(jié)果一致。芽型黃茶的特征香氣屬性為“清香”，其中具有清香屬性的苯乙醛含量較高，在茶葉加工過(guò)程中，由于氧和熱的作用，部分氨基酸會(huì)發(fā)生脫羧或脫氨，產(chǎn)生相應(yīng)的醛，而苯乙醛來(lái)源途徑之一就是苯丙氨酸脫羧后形成，在茶葉中稀釋后具有清香[29]，且苯乙醛被證實(shí)為清香型鐵觀音的關(guān)鍵香氣成分[30]。芽葉型黃茶特征香氣屬性為“清甜”，其中醇類(lèi)含量較高，如己酸乙酯、苯甲醇、香葉醇、苯乙醇、檸檬醛、橙花醛和月桂烯等是具有花香、甜香、果香屬性的揮發(fā)性成分；有研究表明花香特征明顯的香葉醇、苯甲醇和苯乙醇被認(rèn)為是形成安吉紅茶“甜香”、“花香”的主要原因[31]，這些物質(zhì)可能與形成芽葉型黃茶“清甜”香氣屬性有關(guān)。多葉型黃茶香氣屬性為“鍋巴香”，其中具有烘烤香屬性的吡咯類(lèi)及其衍生物含量顯著高于其他兩類(lèi)，這類(lèi)化合物由于具有極高的香氣強(qiáng)度和極低的香氣閾值，因此對(duì)多葉型黃茶的香氣具有重要影響[7]，其含量較高可能與多葉型黃茶特殊加工工序-烘焙密切相關(guān)[32]，同時(shí)，研究證實(shí)，在高溫焙火的過(guò)程中，通過(guò)美拉德反應(yīng)，會(huì)產(chǎn)生大量具有烘烤香屬性的吡嗪類(lèi)物質(zhì)[33-34]。

黃茶作為我國(guó)獨(dú)有的茶類(lèi)，品質(zhì)保障是非常重要的，但目前對(duì)黃茶香氣成分化學(xué)物質(zhì)基礎(chǔ)均不明確，因此，后續(xù)研究應(yīng)加大對(duì)黃茶品質(zhì)方面的研究力度，包括技術(shù)條件與數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)方法，進(jìn)而深入了解黃茶的品質(zhì)特征，從而建立黃茶的質(zhì)量控制模型，提升黃茶品質(zhì)。