LC-MS/MS法測定骨肉瘤患者血清中甲氨蝶呤及其代謝產物7-羥基甲氨蝶呤的濃度*

周 青，張晏潔，薛 源，芮建中，周國華

東部戰區總醫院 臨床藥學科，南京210002

骨肉瘤是臨床常見的原發性骨惡性腫瘤，好發于兒童與青少年，具有病情進展快、肺轉移早、病死率高等特點。目前臨床對骨肉瘤的治療，多以外科治療為主、化療或其他治療為輔[1]。近年來，國內外發布的最新的骨肉瘤診療相關指南均推薦甲氨蝶呤（methotrexate，MTX）作為骨肉瘤的一線化療藥物，而大劑量甲氨蝶呤（HD-MTX）聯合亞葉酸鈣（CF）解救療法已成為治療骨肉瘤的重要手段，該方案可顯著提高患者的生存率[2]。但由于給藥劑量大，MTX 在體內的血藥濃度往往較高，在提高療效的同時也導致毒副反應發生率相應增加，且MTX 在體內代謝具有顯著的個體差異，需密切監測患者血藥濃度，在確保療效的同時也減少不良反應的發生。此外，越來越多的研究表明，MTX 體內主要代謝產物7-羥基甲氨蝶呤（7-OH MTX）的血藥濃度與MTX 不良反應具有相關性[3]。因此，同時監測MTX 及7-OH MTX 的血藥濃度可更為精準、靈敏地預判HD-MTX 臨床不良反應的發生，這對于臨床合理用藥具有重要意義[4]。

本研究建立了一種快速、準確、靈敏的LC-MS/MS 定量分析方法，能夠同時測定人血清中MTX 和7-OH MTX 的藥物濃度，并應用于臨床治療藥物監測（TDM），同時為MTX 人體藥動學研究及個體化用藥實踐提供方法學參考。

1 儀器與藥品、試劑

1.1 儀器

Agilent 1260 高效液相色譜儀（美國Agilent 公司）；API 4000 三重四級桿質譜儀（美國AB 公司）；渦旋混合儀（美國Scientific Industries 公司）；高速冷凍離心機（美國Beckman 公司）；十萬分之一電子天平（瑞士Mettler Toledo 公司）。

1.2 藥品與試劑

甲氨蝶呤對照品（純度99.8%，批號100138-201606，中國食品藥品檢定研究院）；7-羥基甲氨喋呤（7-OH MTX）對照品（純度97%，批號4-JSH-16-2，Toronto Research Chemicals）；內標氨基蝶呤（IS）對照品（純度≥97%，批號039M4021V，Sigma）。甲醇、乙腈、甲酸為色譜純；超純水。

人血清（批號20200508，北京鑫泉永碩科技有限公司）。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：Agilent Zorbax Eclipse Plus C18（2.1 mm×100 mm，3.5 μm）；柱溫：35 ℃；流動相：含0.1%甲酸的水溶液（A 相）和含0.1%甲酸的乙腈溶液（B 相）（梯度洗脫：0～0.5 min，95%A；0.5～1.2 min，95%～20%A；1.2～3.5 min，20%A；3.5～3.6 min，20%～95%A；3.6～6.5 min，95%A）；流速：0.4 mL·min-1；進樣量：2 μL。

2.2 質譜條件

離子源：電噴霧源（ESI）；正離子模式；離子源電壓（IS）：5500 V；離子源溫度（TEM）：550 ℃；碰撞氣體（CAD）壓力9 psi；氣簾氣（CUR）壓力：25 psi；霧化氣（GS1,N2）壓力55 psi，輔助氣（GS2,N2）壓力55 psi。多反應監測（MRM）離子對，MTX、7-OH MTX和內標氨基蝶呤（IS）的監測離子對、去簇電壓（DP）、入口電壓（EP）、碰撞能量（CE）、碰撞室出口電壓（CXP）等見表1。

表1 質譜條件

2.3 對照品和內標溶液的配置

分別精密稱取MTX、7-OH MTX 對照品各5.0mg，分別置于10mL 量瓶中，用甲醇（含0.1N NaOH）溶解并定容至刻度，配制濃度均為500μg·mL-1儲備液，于冰箱-80 ℃避光保存。使用時以甲醇-水（50/50）進一步稀釋成所需濃度的MTX 和7-OH MTX 標準曲線工作液（濃度分別為MTX：20、50、100、200、500、1000、2000、5000、10 000 ng·mL-1；7-OH MTX：200、500、1000、2000、5000、10 000、20 000、50 000、100 000 ng·mL-1）。

精密稱取氨基蝶呤對照品5.0 mg，置于10 mL量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，配制濃度為500 μg·mL-1儲備液，于冰箱-80 ℃避光保存。最后用甲醇稀釋至濃度為20 ng·mL-1的內標工作液。

2.4 樣品處理

精密吸取血清40 μL，置1.5 mL EP 管中，再加入含氨基蝶呤的內標工作液（20 ng·mL-1）160 μL，渦旋混勻1 min，12 500 r·min-1離心10 min；取上清液至進樣瓶，作LC-MS/MS 分析。

2.5 專屬性考察

在“2.1 和2.2”項檢測條件下，取空白人血清、空白人血清+MTX+7-OH MTX、骨肉瘤患者MTX 化療后血清，分別按“2.4”項下方法處理樣品后，進樣分析。結果表明，MTX、7-OH MTX 和內標IS 的色譜峰形良好，其保留時間分別為2.71、2.73 和2.68 min，而空白血清中未發現有內源性物質干擾待測物和內標的測定，表明該方法專屬性良好。見圖1。

圖1 血清中MTX、7-OH MTX 和IS 的MRM 色譜圖

2.6 標準曲線的繪制

取空白血清90 μL，分別加入10 μL 不同濃度的系列標準曲線工作液，配制成含MTX 濃度為2、5、10、20、50、100、200、500、1000 ng·mL-1及含7-OH MTX濃度為20、50、100、200、500、1000、2000、5000、10 000 ng·mL-1系列血清標準曲線樣品，并按“2.4”項下方法處理，進樣2 μL。經LC-MS/MS 分析，以樣品峰面積與IS 峰面積之比（Y）為縱坐標，以血清樣品濃度（X）為橫坐標，作線性回歸，經“1/X2”權重得MTX 和7-OHMTX 的回歸方程；分別為：Y=0.0638X-0.0754（r=0.998 5），Y=0.005 3X+0.0452（r=0.998 4）。結果表明，MTX 及7-OH MTX 分別在2～1000 ng·mL-1及20～10000 ng·mL-1線性關系良好。

2.7 精密度與準確度試驗

分別配制MTX 濃度為2、4、80、800 ng·mL-1，7-OH MTX 濃度為20、40、800、8000 ng·mL-1的血清樣品。按“2.4”項下方法處理血清樣品，每個濃度日內平行測定6 份，連續測定3 天，根據當天的標準曲線，計算待測物峰面積與內標峰面積比值，代入相應標準曲線得到實測濃度，計算日內、日間精密度和準確度。結果見表2。

表2 血清中MTX 及7-OH MTX 濃度測定的精密度與準確度（n=6）

2.8 穩定性試驗

分別配制MTX 濃度為80、800 ng·mL-1，7-OH MTX 濃度為800、8000 ng·mL-1的血清質控樣品。按“2.4”項下方法處理血清樣品，分別考察血清樣本室溫下放置8 h、4 ℃中放置24 h、反復凍融3 次和-20 ℃冷凍放置7 d 后MTX 和7-OH MTX 的穩定性。每個濃度平行測定5 份。結果表明，兩個濃度質控樣品在4 種儲存條件下穩定，結果見表3。

表3 血清中MTX 及7-OH MTX 濃度測定的穩定性（n=5）

2.9 基質效應與提取回收率

分別配制MTX 濃度為2、4、80、800 ng·mL-1，7-OH MTX 濃度為20、40、800、8000 ng·mL-1的血清樣品，按“2.4”項下方法處理血清樣品，每個濃度平行測定5 份，進樣獲得相應峰面積A；另取空白血清，按“2.4”項下方法處理空白血清（其中，內標工作液換成純甲醇），再用提取的上清液分別配制MTX濃度為2、4、80、800 ng·mL-1，7-OH MTX 濃度為20、40、800、8000 ng·mL-1的樣品，按“2.4”項下方法處理樣品，每個濃度平行測定5 份，進樣獲得相應峰面積B；以流動相分別配制MTX 濃度為2、4、80、800 ng·mL-1、7-OH MTX 濃度為20、40、800、8000 ng·mL-1的樣品。按“2.4”項下方法處理樣品，每個濃度平行測定5 份，進樣獲得相應峰面積C。計算MTX、7-OH MTX 及IS 的基質效應和提取回收率，公式為：基質效應=（B/C）×100%；提取回收率=（A/B）×100%。結果見表4。

表4 血清中MTX、7-OH MTX 及IS 濃度測定的基質效應與提取回收率（n=5）

2.10 臨床應用

臨床骨肉瘤患者2 例，均為男性，年齡分別為17、19 歲，MTX 化療劑量分別為5.38、6.00 g·m-2。給藥后于不同時間點（～4 h、～8 h、～24 h、～48h、～72 h）測定血清中MTX 及7-OH MTX 的濃度，其中，第1、2、3 個時間點（～4 h、～8 h、～24 h）的血清，在按照“2.4”項下方法處理樣品前，分別用空白血清稀釋1000、200、10 倍。結果見表5、表6。

表5 骨肉瘤患者1 的血藥濃度監測結果

表6 骨肉瘤患者2 的血藥濃度監測結果

3 討論

MTX 是一種抗葉酸類抗腫瘤藥物，能夠競爭性地抑制細胞中二氫葉酸還原酶的活性，阻止二氫葉酸還原為四氫葉酸，使得嘌呤、嘧啶核苷酸的合成受阻，從而抑制DNA 的生物合成，最終抑制腫瘤細胞的生長與繁殖。大劑量甲氨蝶呤（HD-MTX）聯合亞葉酸鈣（CF）解救是治療骨肉瘤重要方案之一。

MTX 細胞毒作用具有非特異性，在殺傷腫瘤細胞的同時對快速分裂的正常細胞（骨髓細胞、肝細胞等）也會造成一定的細胞毒作用，而大劑量使用甲氨蝶呤則意味著毒性加劇。臨床上常采用CF 進行解救，但CF 解救HD-MTX 引起的不良反應的同時也會拮抗MTX 的藥理作用，減弱MTX 對腫瘤細胞的毒性作用，從而影響治療效果；并且使MTX 藥代動力學特征存在較大的個體差異。因此，HD-MTX化療后，需進行MTX 血藥濃度監測，適時、適量地給予CF 解救，在保證HD-MTX 治療效果的同時，還能防止嚴重不良反應的發生。有研究表明，MTX體內主要代謝產物7-OH MTX 的血藥濃度與MTX給藥后的不良反應（腎毒性、肝毒性等）相關。因此，本研究選擇同時測定MTX 和7-OH MTX 的血藥濃度，為實行個體化用藥提供科學的指導依據。

目前，臨床常用的治療藥物監測方法有化學發光免疫分析法（CLIA）[5]和高效液相色譜法（HPLC）[6，7]。CLIA 法雖然操作相對簡單、自動化程度高；但其配套的試劑盒成本較高，且易受代謝產物的干擾和發生交叉反應，會影響測定結果的準確性。HPLC 法雖然靈敏度高、選擇性較好；但存在樣品前處理復雜、分析時間較長等缺點，難以滿足臨床時效性和大樣本的快速檢測。相比而言，LC-MS/MS 法具有靈敏度高、特異性強、檢測速度快、檢測限低等優勢。

綜上所述，骨肉瘤患者經HD-MTX 化療后，進行治療藥物監測，指導臨床個體化用藥是很有必要的。本研究建立了一種快速、簡單、靈敏度高、準確度好的LC-MS/MS 檢測方法，用于同時監測MTX及其代謝產物7-OH MTX 的血藥濃度，對臨床實施個體化HD-MTX 聯合CF 治療方案、保障治療效果及用藥安全具有指導意義。