雷帕霉素通過激活LC3介導的細胞自噬改善ApoE4/5×FAD小鼠的認知功能*

崔曉麗， 魏 振， 沈 輝， 張 靜， 戴曉曼， 張 健， 陳曉春， 曾育琦△

（1福建中醫藥大學附屬人民醫院老年病科暨干部病房，2福建省立醫院神經內科，福建醫科大學省立臨床醫學院，3福建醫科大學附屬協和醫院干部病房，4福建醫科大學附屬協和醫院福建省老年醫學研究所，5福建醫科大學附屬協和醫院神經內科，福建福州350001）

阿爾茨海默?。ˋlzheimer disease，AD）是一種常見的以記憶障礙為主要表現的神經系統退行性疾病，β-淀粉樣蛋白（amyloidβ-protein，Aβ）沉積和神經原纖維纏結（neurofibrolary tangles，NFTs）形成是其主要病理改變。AD的確切機制尚不清楚，目前缺乏有效的藥物治療手段。

細胞自噬對維持內環境穩態起重要作用，可降解并循環利用自身老化組分及功能異常的大分子物質，通過溶酶體水解酶降解長壽命蛋白和錯誤折疊蛋白，是神經元溶酶體降解途徑所必需的。研究表明，自噬功能障礙參與了AD發?。?］。自噬在清除毒性或異常聚集蛋白（如Aβ和tau蛋白等）中起著至關重要的作用［2-4］；抑制自噬可加重AD的病理損害［5］，反之則減輕AD病理損害［6］。雷帕霉素（rapamycin，Rapa）是一種經典的自噬激動劑，通過抑制哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）激活自噬，是自噬研究中最常用的藥物。既往研究表明雷帕霉素可抑制mTOR、調節自噬相關通路后改善認知，延緩神經退行性疾病的進展［7-8］。

人類載脂蛋白E（apolipoprotein E，ApoE）主要有3種亞型：ApoE2、ApoE3和ApoE4，其中ApoE4是散發性AD最大的風險基因。ApoE4可上調腦內Aβ水平，促進淀粉樣斑塊沉積［9-11］。但ApoE與Aβ之間如何相互作用導致認知功能障礙以及ApoE4是否通過影響自噬作用參與AD的病理過程尚不明確。ApoE4增加AD患者腦內炎癥和氧化應激，引起溶酶體膜脂質過氧化，導致溶酶體功能障礙［12］。在AD腦中，ApoE通過調節高密度脂蛋白膽固醇和膽固醇的代謝直接影響自噬體-溶酶體系統的激活［13］，也可通過增加Aβ和磷酸化的tau水平誘導自噬。因此ApoE可能參與AD腦內自噬溶酶體的調節，但其潛在的機制卻鮮為人知。同時表達5種家族性AD（fa?milial AD，FAD）突變基因（5×FAD）及人類ApoE亞型的小鼠（EFAD小鼠）為探索ApoE參與AD發病機制研究提供了很好的模型。本研究以EFAD小鼠為研究對象，觀察ApoE3和ApoE4基因對其認知功能的影響及對自噬相關病理是否存在差異，進一步探討雷帕霉素是否可通過增強自噬改善不同ApoE基因型EFAD小鼠的認知功能。

材料和方法

1 藥物及試劑

雷帕霉素購自LCLaboratories；蛋白酶抑制劑購自Sigma；基因型鑒定DNA Ladder購自Fermentas；2×Go-Taq Green Master Mix購自Promega；hAPP695引物購自Sangon Biotech；BCA試劑盒購自Beyotime；鼠抗β-actin單克隆抗體、兔抗LC3B多克隆抗體購自Abcam；兔抗p-mTOR多克隆抗體和兔抗mTOR單克隆抗體購自Cell Signaling Technology；鼠單克隆抗體6E10購自Covance；Aβ1-42ELISA試劑盒購自Invitro?gen；BCA蛋白檢測試劑盒購自Beyotime；生物素標記的抗鼠Ⅱ抗購自Vector。

2 動物及藥物處理

所有實驗都是根據福建醫科大學動物護理和使用委員會協議的規則和規定進行的，并按照國際動物倫理使用指南進行。置換人ApoE3和ApoE4基因的C57/B6小鼠及5×FAD小鼠由Ladu教授（美國伊利諾伊大學芝加哥分校）贈送，在福建醫科大學SPF級

實驗動物中心建系、飼養、繁殖，許可證號為SYXK（閩）2008-0001。5×FAD小鼠轉染了5個FAD突變基 因［APP K670N/M671L（Sweden）+I716V（Flori?da）+V717I（London）+PS1M146L+L286V）］。5×FAD小鼠與置換人ApoE3和ApoE4基因的小鼠雜交，經過基 因 型 鑒 定 后 篩 選 出ApoE3/5×FAD（E3FAD）和ApoE4/5×FAD（E4FAD）小鼠。將雷帕霉素溶解于二甲基亞砜中，配成200 g/L的儲藏液，灌胃時稀釋為75 mg/L。

3 主要方法

3.1 實驗分組 將EFAD小鼠隨機分為2組：溶媒對照組（vehicle組）和雷帕霉素治療組（Rapa組），每組8只。6月齡時雷帕霉素（1 mg/kg）灌胃，每天1次，共6周。給藥結束后檢測行為學、收集標本。

3.2 水迷宮行為學檢測 Morris水迷宮用于評價EFAD鼠的視空間學習記憶能力。隱藏平臺實驗包括連續6 d、每天4次嘗試尋找隱藏平臺的游泳訓練。記錄每次試驗的逃避潛伏期。記憶保留實驗（空間探索）是在最后一天的隱藏平臺訓練結束后24 h，將平臺移出，記錄小鼠60 s內游泳軌跡、穿越原平臺的次數、平臺所在象限停留時間百分比和距離平臺的平均距離。

3.3 組織獲取 行為學實驗結束后，用10%水合氯醛（3 mL/kg）腹腔注射麻醉EFAD小鼠，右心室取血，冰上剝離腦組織，右側大腦半球用4%多聚甲醛固定24 h，經脫水、快速冷凍后，?80℃保存至切片。左側大腦半球分離出海馬和皮層，一部分海馬標本進行透射電鏡觀察，另一部分海馬標本在液氮中快速冷凍，?80℃保存至組織裂解。

3.4 透視電鏡觀察 將上述用于電鏡觀察的海馬組織CA1區切割成大小約1 mm×1 mm×1 mm的組織塊，經脫水、兩次固定、浸透、包埋、聚合等處理后切片，再經染色、水洗后，在透射電鏡下觀察拍照。

3.5 免疫組織化學 在冷凍切片機（CM1850，Lei?ca）上將右側大腦半球切成30μm厚的切片，并在-20℃下保存于防凍溶液中。實驗時用TBS洗滌6×10 min去除防凍溶液，3%過氧化氫淬滅內源性過氧化物酶，室溫封閉1 h，加Ⅰ抗6E10（1∶20 000）4℃孵育48 h，經TBS洗滌后，生物素標記的抗鼠Ⅱ抗（1∶600）室溫孵育90 min，ABC放大液室溫孵育60 min，DAB顯色，漂洗后貼片、封片，顯微鏡下拍照。

3.6 Western blot分析 將上述分離的海馬組織按比例加入預冷的組織裂解液，超聲裂解提取蛋白，用BCA蛋白檢測試劑盒測定蛋白濃度。用8%或12%的SDS-PAGE分離等量的蛋白，并轉移到PVDF膜上。室溫封閉2 h后移入用封閉液稀釋的Ⅰ抗（mTOR、pmTOR、LC-3和β-actin抗體，均1∶2 000）中4℃過夜，TBST洗滌，加入辣根過氧化物酶標記的IgGⅡ抗（1∶2 000）孵育90 min，化學發光法顯色，X射線底片曝光。通過ImageJ軟件進行灰度分析。

3.7 ELISA測定海馬組織Aβ1-42含量 海馬組織中加入預冷的組織裂解液，超聲裂解提取蛋白，16 000×g、4℃離心25 min，吸取上清液為TBST溶解的Aβ1-4（2TBST-Aβ1-42）；上述沉淀物16 000×g、4℃離心5 min，棄上清液，加入400μL 5 mol/L鹽酸胍溶液，震蕩EP管，使沉淀物與管底分離，室溫搖4 h后16 000×g、4℃離心5 min，收集上清液即為胍溶性Aβ1-4（2guanidine-Aβ1-42）。測定蛋白濃度后，按照Aβ1-42ELISA試劑盒操作說明測定Aβ1-42濃度。

4 統計學處理

數據采用SPSS 16.0軟件包進行分析，并用GraphPad Prism軟件繪圖。正態分布數據以均數±標準誤（mean±SEM）表示。Morris水迷宮潛伏期的數據通過重復測量多因素方差分析進行統計，其余資料采用多因素方差分析。以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 雷帕霉素改善EFAD小鼠的認知功能

通過Morris水迷宮實驗評價雷帕霉素對不同ApoE基因型小鼠空間學習和工作記憶的影響。尋找隱藏平臺訓練的實驗，記錄小鼠尋找隱藏平臺的潛伏期如圖1A所示：在溶媒對照組，E3FAD小鼠的潛伏期比E4FAD小鼠更短（P<0.05）；雷帕霉素處理后，E3FAD小鼠和E4FAD小鼠的潛伏期均明顯縮短，且兩2組之間的差異無統計學顯著性。經過6 d的訓練后，移去隱藏平臺進行探索實驗，結果顯示，在溶媒對照組，與E3FAD小鼠比較，E4FAD小鼠穿越平臺次數少、距離平臺平均距離延長（P<0.05）；雷帕霉素處理后，與相應溶媒對照組相比，E3FAD小鼠與E4FAD小鼠穿越平臺次數均增加、在平臺所在象限停留時間均延長、距離平臺平均距離均縮短（P<0.05），雷帕霉素處理后E3FAD小鼠與E4FAD小鼠之間上述指標的差異無統計學顯著性，見圖1B~D。小鼠尋找隱藏平臺的游泳軌跡（典型例子，圖1E）可以直觀觀察對照組的EFAD小鼠漫無目的地尋找隱藏的平臺，接受雷帕霉素治療的EFAD小鼠大部分時間停留在平臺所在象限。Morris水迷宮實驗結果顯示，E4FAD小鼠的空間學習記憶能力較E3FAD小鼠下降；雷帕霉素對E3FAD小鼠和E4FAD小鼠的認知功能均有改善作用，經其治療后這兩種基因型小鼠認知功能的差異無統計學顯著性，提示雷帕霉素改善EFAD小鼠（特別是攜帶ApoE4基因的小鼠）的空間記憶能力。

Figure 1.Rapamycin（Rapa）improved learning and memory in EFADmice.Escape latency（A）was significantly longer in E4FAD-vehicle group than that in E3FAD-vehicle group.It was shorten in both E3FAD and E4FAD mice after Rapa treatment.In the probe trial，the number of crossing（B），time spent in the target quadrant（C），the mean distance to the platform（D）and the swimming trajectories for the probe trials（E）were recorded.The number of crossing and the time spent in the tar?get in E4FAD-vehicle group were less than those in E3FAD-vehicle group，while the distance to the platform was longer than that in E3FAD-vehicle group.Treatment with Rapa increased the number of crossing and the time spent in the target，and decrease the distance to the platform in both E3FAD and E4FAD mice.Means±SEM.n=6.*P<0.05，**P<0.01 vs E3FAD-vehicle group；##P<0.01 vs E4FAD-vehicle group.圖1 雷帕霉素改善EFAD小鼠的認知功能

2 雷帕霉素減少EFAD小鼠Aβ沉積，降低Aβ水平

通過免疫組化方法應用6E10抗體檢測海馬Aβ水平。與E3FAD小鼠相比，E4FAD小鼠海馬內的Aβ沉積更明顯；而雷帕霉素顯著減少了E3FAD和E4FAD小鼠海馬內Aβ的聚集，見圖2A。我們進一步采用ELISA法檢測了Aβ1-42水平，結果與免疫組織化學一致。雷帕霉素處理后，E3FAD小鼠和E4FAD小鼠的TBST-Aβ1-42水平與對照組相比分別下降了26.2%和22.3%（P<0.05）；E4FAD小鼠腦內的gua?nidine-Aβ1-42水平幾乎是E3FAD小鼠的2倍（P<0.01）；與對照組比較，雷帕霉素處理后E4FAD小鼠腦內guanidine-Aβ1-42水平降低了30%（P<0.05），但E3FAD小鼠的guanidine-Aβ1-42水平無明顯變化，見圖2B。這些數據表明，E4FAD小鼠比E3FAD小鼠具有更高水平的guanidine-Aβ1-42，雷帕霉素治療后，E3FAD小鼠和E4FAD小鼠腦內的TBST-Aβ1-42水平均顯著下降，但是僅E4FAD小鼠腦內的guanidine-Aβ1-42水平降低。

Figure 2.Rapamycin（Rapa）reduced Aβdeposits in the hippocampus of EFAD mice.A：immunohistochemical staining for Aβde?posits showed that amyloid plaques in the hippocampal CA1 region（black arrow）and dentate gyrus（white arrow）in E3FAD mice were fewer than those in E4FAD mice，and Rapa reduces Aβdeposits in EFAD mice（scale bar=100μm）；B：Aβ1-42 levels in hippocampal homogenates of EFAD mice were detected by ELISA.Means±SEM.n=6.*P<0.05，**P<0.01 vs E3FADvehicle group；##P<0.05 vs E4FAD-vehicle group.圖2 雷帕霉素減少EFAD小鼠Aβ沉積，降低Aβ水平

3 雷帕霉素抑制EFAD小鼠海馬組織mTOR活化并激活細胞自噬

自噬小體能將細胞內待降解的大分子或毒性物質，如Aβ，運送至溶酶體內降解［14］。LC3-II的含量與自噬程度成正比。我們評估了mTOR及其磷酸化形式和自噬標志物LC3-II/LC3-I的蛋白水平。如圖3所示，雷帕霉素處理后E3FAD和E4FAD小鼠海馬組織中p-mTOR/mTOR蛋白水平較對照組分別降低了16%和50%（P<0.05）；在對照組，E4FAD小鼠海馬組織LC3-II/LC3-I蛋白水平較E3FAD下降40%（P<0.05），雷帕霉素可顯著升高LC3-II/LC3-I的表達（P<0.05），并且雷帕霉素治療后，E3FAD組和E4FAD組LC3-II/LC3-I蛋白水平的差異無統計學顯著性（P>0.05）。以上結果表明，雷帕霉素在EFAD小鼠中抑制mTOR活化，進而上調自噬標記蛋白的表達。

4 雷帕霉素降低EFAD小鼠自噬小體電子致密物

透射電鏡下自噬小體表現為雙層膜囊泡結構（圖4，白色箭頭）。E3FAD和E4FAD小鼠海馬CA1區可見大量功能障礙的自噬空泡，空泡中含有未降解的電子致密物，且缺乏完整的雙層膜結構（圖4，黑白箭頭）。E4FAD組異常自噬體數量明顯多于E3FAD組。雷帕霉素處理后EFAD組完整的雙層膜結構增加，其內電子致密物減少、密度降低，提示雷帕霉素降低了EFAD小鼠自噬小體內的電子密度，增加了包裹在自噬小體中的異常聚集物質的降解。

Figure 3.Rapamycin（Rapa）inhibited the expression of mTOR（A），and up-regulated LC3-II/LC3-Iratio（B）in the hippocampus of EFAD mice.Mean±SEM.n=3.*P<0.05 vs E3FAD-vehicle group；##P<0.01 vs E4FAD-vehicle group；△P<0.05 vs E3FAD-Rapa group.圖3 雷帕霉素抑制EFAD小鼠mTOR表達并激活自噬

5 雷帕霉素對EFAD小鼠的體重、血常規和生化指標無顯著影響

雷帕霉素灌胃期間，每周測定小鼠體重（表1），灌胃結束后測定血常規（表2）和生化指標（表3）。以上數據顯示，該治療劑量下雷帕霉素對EFAD小鼠體重、血細胞及肝腎功能無顯著影響（P>0.05）。

表1 雷帕霉素對EFAD小鼠體重的影響Table 1.Effects of rapamycin（Rapa）on body weight in EFADmice（g.Mean±SEM.n=8）

表2 雷帕霉素對EFAD小鼠血常規指標的影響Table 2.Effects of rapamycin（Rapa）on blood routine indexesin EFADmice（Mean±SEM.n=6~8）

表3 雷帕霉素對EFAD小鼠生化指標的影響Table 3.Effects of rapamycin（Rapa）on biochemical indexes in EFADmice（Mean±SEM.n=6~8）

討 論

AD一種嚴重威脅老年人身心健康的慢性進展性神經變性疾病，目前臨床尚無有效的治愈手段和明確可延緩疾病進展的藥物。ApoE4作為AD最重要的風險因素，是否參與調節AD病程中自噬功能，國內外鮮有報道。雷帕霉素是一種FDA批準的免疫抑制劑，在延緩衰老及相關疾病方面顯示重要的保護作用。因此，本項目擬從老藥新用的角度探討雷帕霉素是否影響不同ApoE基因型的癡呆鼠腦內自噬通路、Aβ代謝以及認知功能。

腦內Aβ的形成和沉積是AD重要的病理特征。腦內Aβ包括神經元細胞漿內可溶性的Aβ和細胞外淀粉樣斑塊。Aβ有多種形式，其中Aβ1-42和Aβ1-40是最常見的。盡管Aβ1-42的數量僅為Aβ1-40的10%，但相對于Aβ1-40，Aβ1-42表現出更強的神經毒性作用，并且是腦內淀粉樣斑塊的主要成分。ApoE4是散發型AD最重要的遺傳風險基因，不僅可減少Aβ的清除［15］，還可增加tau蛋白的磷酸化［16］，從而加劇學習和記憶障礙。與ApoE3神經元相比，ApoE4神經元分泌Aβ1-42增加，且ApoE4星形膠質細胞攝取Aβ障礙［10］。同時，ApoE4與Aβ的結合會導致Aβ構象從隨機螺旋轉變為β片層結構，從單體凝結成不溶性物質，參與Aβ的沉積［17］。我們的研究提示，與E3FAD小鼠比較，E4FAD小鼠腦內Aβ增多，認知功能明顯下降，證實ApoE4可能通過促進Aβ的沉積加劇認知損害。由于人群中ApoE2基因型攜帶頻率低，且已被證實具有神經保護作用［18］，因此ApoE3和ApoE4這2個基因型如何影響AD病理受到國內外學者更多的關注。

自噬是一種依賴溶酶體的降解途徑，主要過程包括自噬體的形成、成熟、自噬體與溶酶體的結合及溶酶體降解4個階段，主要承擔真核細胞內長壽命蛋白質和細胞器的降解，對細胞生長、增殖及維持內環境穩態起著重要作用［4］。自噬在清除受損細胞器及異常聚集的毒性蛋白中起重要作用，mTOR是自噬的負調控因子。在自噬過程中，LC3是自噬的標志物，LC3-II由LC3-I轉化而來，被認為是自噬的分子標志物，存在于自噬小體的雙層膜結構。正常腦組織內很少有自噬小體形成，但是在AD腦內自噬體的數量和溶酶體系統的形態學發生了顯著的變化。有研究顯示AD模型鼠出現自噬功能障礙，不能有效清除Aβ［19］和磷酸化tau［20］，引起Aβ和tau的異常聚集。目前，關于不同的ApoE亞型（尤其是ApoE4）是否影響AD自噬系統和Aβ代謝的研究比較少。本研究發現，與E3FAD小鼠相比，E4FAD小鼠自噬標志物LC3的下降更明顯，功能異常的自噬小體和待降解物質增多，Aβ的含量升高，提示ApoE4加重了自噬功能障礙和Aβ沉積。

Figure 4.Autophagosomes in the hippocampal CA1 region observed under transmission electron microscope.Rapamycin（Rapa）in?creased the number of double-membrane vacuoles（white arrow）and lowered the density of undigested materials enclosed in autophagosomes（white arrow with black core）.The scale bar=1μm.圖4 雷帕霉素減少EFAD小鼠海馬內細胞自噬小體電子致密物

mTOR參與神經元的發育和可塑性［21］，在衰老的大腦中，mTOR通路調節紊亂導致認知功能下降［22］。mTOR、Aβ的產生和AD之間有著密切聯系［23］。激活mTOR通過調節自噬途徑可增加Aβ的合成并抑制其清除［19］。抑制PI3K/Akt/mTOR信號通路增強自噬后可減少Aβ聚集，從而改善APP∕PS1小鼠的認知功能［8，24］。臨床病理學研究顯示AD早期即出現mTOR信號通路的激活，但輕度認知障礙和AD患者之間pmTOR無明顯差異［23］。這與本研究6月齡E3FAD和E4FAD小鼠的p-mTOR/mTOR水平沒有顯著差異是一致的，可能與mTOR信號通路激活后的“天花板效應”有關。

雷帕霉素通過抑制mTOR激活自噬，是目前最常用的自噬激動劑。既往研究顯示雷帕霉素增強自噬，減輕AD轉基因小鼠淀粉樣蛋白沉積和tau蛋白相關的病理損害［25］，同時具有延緩并減輕組織器官衰老作用［26］。但雷帕霉素對不同ApoE基因型的AD轉基因小鼠自噬功能的影響尚不清楚。本研究首次探索ApoE3和ApoE4基因型對AD轉基因小鼠的自噬溶酶體系統的影響及雷帕霉素的作用。我們發現雷帕霉素可以改善E3FAD小鼠和E4FAD小鼠的空間導航和參考記憶，減少Aβ沉積，與既往研究結果相一致［27］。雷帕霉素抑制EFAD小鼠p-mTOR表達，增加自噬標志物LC3-II的表達。有趣的是，雷帕霉素處理后不改變E3FAD組的guanidine-Aβ1-42水平，卻顯著地降低E4FAD小鼠腦內的guanidine-Aβ1-42水平，進而縮小E4FAD與E3FAD之間認知差距，提示雷帕霉素這一神經保護作用與ApoE基因型有關，在E4FAD組中尤為明顯。

綜上所述，我們的實驗結果顯示不同ApoE基因型對5×FAD轉基因小鼠學習、記憶、Aβ代謝和自噬功能的影響存在差異。與E3FAD小鼠相比，E4FAD小鼠認知能力和自噬功能受損更為明顯，Aβ水平更高。雷帕霉素可以改善E3FAD小鼠和E4FAD小鼠的認知功能，其可能的機制包括抑制mTOR活化、激活LC3介導的自噬和促進Aβ降解，這些作用對攜帶ApoE4基因型的轉基因小鼠更明顯，而且該治療劑量（1 mg·kg?1·d?1）的雷帕霉素無明顯毒副作用。以上研究提示雷帕霉素是一種潛在的治療AD的藥物，特別是對ApoE4基因攜帶者可能更有臨床應用前景。