卡絡磺鈉通過抑制parkin介導的線粒體自噬減輕膿毒癥大鼠的肺損傷*

王佳興， 付鶴鵬， 王蓓蕾， 于井剛， 劉向迪， 劉瑩瑩， 徐 成， 張玉想△

（1解放軍總醫院第八醫學中心重癥醫學科，北京100091；2滄州市中西醫結合醫院重癥醫學科，河北滄州061001）

膿毒癥的病理生理特征是感染引起宿主體內失控性的炎癥反應，這導致機體內組織和器官功能損傷，嚴重可進展為多臟器功能衰竭［1］。急性肺損傷和急性呼吸窘迫綜合征是膿毒癥的并發癥之一［2］。但目前對膿毒癥肺損傷的機制和治療方法仍不十分明確。

線粒體自噬可以清除細胞內受損線粒體，是線粒體動態平衡的重要保護機制［3-4］。然而，線粒體自噬的過度激活則會加重線粒體損傷，加速細胞衰亡［5］。Pink1（PTEN-induced putative kinase 1）/parkin通路是線粒體自噬的經典通路之一。已有研究證實，parkin參與了膿毒癥肺損傷的形成，抑制parkin的過度表達則可減輕膿毒癥引起的肺損傷［6-7］。

卡絡磺鈉（carbazochrome sodium sulfonate，Car）是一種腎上腺色素縮氨脲與磺酸鈉的復合物，其主要是通過提高毛細血管壁的彈性而降低血管通透性，增強血管損傷部位的回縮能力而減少出血或止血［8］。既往研究顯示，卡絡磺鈉可以降低大鼠肺血管通透性，減輕大鼠放射性肺損傷［9］。本研究通過建立盲腸結扎穿孔（cecal ligation and puncture，CLP）膿毒癥大鼠模型，觀察卡絡磺鈉對膿毒癥大鼠生存率、肺影像學、肺組織病理學、肺血管通透性及肺組織凋亡和線粒體自噬水平的影響，探討其可能機制，為膿毒癥肺損傷的救治提供參考資料。

材料和方法

1 材料

清潔級8周齡雄性Wistar大鼠115只，體重220~240 g，由斯貝福（北京）生物技術有限公司提供，許可證號為SYXK（軍）2012-0016。注射用卡絡磺鈉（武漢華龍生物制藥有限公司，每支20 mg）；伊文思藍（Evans blue，EB；Sigma）；TUNEL試劑盒（Roche）；兔抗大鼠parkin多克隆抗體和小鼠抗大鼠Tom20單克隆抗體（Abcam）；兔抗大鼠微管相關蛋白1輕鏈3（microtubule-associated protein 1 light chain 3，LC3）和GADPH多克隆抗體（CST）；辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔多克隆抗體（北京中衫生物技術有限公司）；其他試劑均為國產分析純。Micro-CT系統（Sie?mens）；DM4000 B光學顯微鏡（Leica）；Spot On圖像采集處理系統（Nikon）；凝膠成像系統（Bio-Rad）。

2 方法

2.1 膿毒癥大鼠模型制備 按照Hubbard等［10］報道的方法行大鼠CLP，復制嚴重腹腔感染致膿毒癥模型。動物術前稱重、編號，并禁食12 h，自由飲水。3%戊巴比妥（40 mg/kg）進行腹腔注射麻醉。大鼠麻醉后固定，沿腹中線做一長約15 cm的切口，逐層切開，暴露直腸并小心游離其盲端，在距盲端1 cm處結扎，用18號針頭貫穿2次，擠出少量腸內容物，并留置一條2 mm寬的橡皮條貫通盲腸，防止針孔閉合。然后將盲腸小心移入腹腔，逐層縫合腹壁切口。術后動物可自由活動和飲水。假手術組只開腹翻動腸管后關腹，不結扎和穿孔盲腸。

2.2 實驗動物分組 將雄性Wistar大鼠隨機分為5組：假手術組、膿毒癥組、卡絡磺鈉低劑量（8 mg/kg）組、卡絡磺鈉中劑量（40 mg/kg）組和卡絡磺鈉高劑量（80 mg/kg）組，每組23只大鼠，其中每組15只大鼠用于生存率研究，其余8只大鼠用于術后24 h研究。實驗過程均經解放軍總醫院第八醫學中心實驗動物管理委員會批準。假手術組除不結扎盲腸及盲腸穿孔外，余同膿毒癥組。卡絡磺鈉低、中、高劑量組大鼠分別于術后即刻、8 h和16 h用不同劑量的注射用卡絡磺鈉（8、40和80 mg/kg，腹腔內注射）干預。膿毒癥組大鼠于同時點腹腔注射等體積生理鹽水。

2.3 大鼠72 h生存率的觀察 每組隨機取15只大鼠，術后分別于6、12、24、36、48和72 h觀察其生存情況并記錄，計算各組生存率。

2.4 大鼠肺部Micro-CT檢測 術后24 h，采用異氟烷吸入將大鼠麻醉，利用Micro-CT儀記錄大鼠肺部的影像學，測量參數：攝片時間120 s，電壓90 kV，電流160μA，照片像素為40μm。

2.5 大鼠肺組織病理學觀察 剪取右肺下葉組織小塊，浸入4%多聚甲醛內固定，梯度乙醇脫水，常規石蠟包埋、切片（5μm），蘇木精-伊紅（hematoxylineosin，HE）染色，光鏡下觀察肺組織病理學變化。在DM4000 B光學顯微鏡（×200）下隨機選取10個視野，參照Hong等［11］標準進行肺組織病理損傷評分。評分項目包括肺泡腔充血、中性粒細胞浸潤、纖維蛋白滲出和肺泡間隔增寬，每項的評分按損傷程度分為0、1、2和3分，分別為無損傷、輕度損傷、中度和重度損傷，取其平均值。

2.6 大鼠肺血管通透性測定 采用EB染料滲出技術［12］。溶于生理鹽水的EB，以2 mL/kg從大鼠尾靜脈注射。然后用磷酸鹽緩沖液（phosphate-buffered saline，PBS）10 mL沖洗肺循環。取右下肺葉約0.2 g，浸泡在2 mL甲酰胺溶液中（10 mL/kg），然后與甲酰胺在60℃的條件下共孵育16 h，待肺組織中色素全部萃取出，取出組織，7 000×g離心10 min后取上清液，測量吸光度（A），并計算組織中的EB含量。

2.7 TUNEL法測定凋亡 大鼠肺組織石蠟切片經過梯度乙醇脫蠟，脫水后，吹干，PBS清洗3次，封閉液室溫封閉1 h。以3%的H2O2阻斷內源性過氧化物酶10 min后，PBS清洗2次。按照TUNEL試劑盒說明要求，進行TUNEL染色和DAPI染色，應用熒光顯微鏡（Nikon）觀察肺組織中細胞凋亡情況。綠色熒光為凋亡細胞，藍色熒光為細胞核。每張切片顯微鏡下隨機選取5個視野，計算各組肺組織細胞凋亡指數。

2.8 Western blot測定大鼠肺組織中parkin和LC3的蛋白含量 100μg大鼠左肺組織裂解液進行SDSPAGE，轉膜，脫脂奶粉封閉。Ⅰ抗為兔抗大鼠parkin（1∶1 000）和LC3（1∶800）多克隆抗體。Ⅱ抗為辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG（1∶5 000），增強化學發光法顯色。以GADPH作內參照。以特異性蛋白條帶光密度值與對應GADPH蛋白條帶光密度值間的比值對相關蛋白表達量進行半定量分析。

2.9 免疫熒光檢測 大鼠肺組織石蠟切片經過梯度乙醇脫蠟，脫水后，吹干，PBS清洗3次，1‰Triton-X-100與2%羊血清混合室溫封閉1 h。PBS清洗后，加入Ⅰ抗［兔抗大鼠多克隆抗體：Tom20（1∶100）、parkin（1∶50）或LC3（1∶50）］，4℃孵育過夜。清洗Ⅰ抗后，加入山羊抗兔熒光Ⅱ抗（DyLight 594，1∶500）或山羊抗小鼠熒光Ⅱ抗（DyLight 488，1∶500）后，室溫孵育30 min。PBS清洗后，DAPI染細胞核。應用熒光顯微鏡（Nikon）觀察Tom20、parkin和LC3在肺組織中的表達情況。

3 統計學處理

采用SPSS17.0軟件進行統計分析。數據均采用均數±標準差（meann±SD）表示。多組之間比較采用單因素方差分析，多重比較用SNK-q檢驗。以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 卡絡磺鈉對膿毒癥大鼠生存率的影響

與膿毒癥大鼠相比，所有卡絡磺鈉組大鼠的生存率均顯著升高（P<0.05）；與低劑量組相比，中劑量和高劑量卡絡磺鈉組大鼠的生存率也顯著升高（P<0.05）；而中劑量和高劑量之間的大鼠生存率無顯著差異（P>0.05），見圖1。

Figure 1.Carbazochrome sodium sulfonate（Car）increased the survival rate of the septic rats.Mean±SD.n=15.**P<0.01 vs sham group；#P<0.05，##P<0.01 vs sepsis group；△P<0.05 vs Car（8 mg/kg）group.圖1 卡絡磺鈉提高膿毒癥大鼠生存率

2 卡絡磺鈉對膿毒癥大鼠肺影像學的影響

大鼠肺Micro-CT結果顯示，膿毒癥大鼠雙肺可見斑片狀滲出，嚴重可發生肺不張和肺實變（圖2B紅色箭頭所示）。給予卡絡磺鈉干預后，大鼠雙肺的斑片滲出顯著減少，未見明顯的肺不張和肺實變；且隨著藥物劑量的增加，大鼠肺部炎癥表現逐步減輕，見圖2C~E。

3 卡絡磺鈉對膿毒癥大鼠肺血管通透性的影響

如圖3所示，與假手術組相比，膿毒癥大鼠肺血管通透性顯著增加（P<0.05）；低劑量、中劑量和高劑量卡絡磺鈉組大鼠的肺血管通透性均低于膿毒癥組（P<0.05）；中、高劑量組大鼠的肺血管通透性較低劑量組均進一步降低（P<0.05）。

4 卡絡磺鈉減輕膿毒癥引起的大鼠肺組織學改變

HE染色結果顯示，假手術組大鼠肺組織肺泡壁光滑，肺泡腔無滲出且結構清晰完整，見圖4A；膿毒癥組大鼠肺組織肺泡腔出現大量紅細胞、炎癥細胞和血漿樣物質滲出，肺泡間隔和肺泡壁明顯增厚不均，部分肺泡腔塌陷（圖4B），肺病理評分明顯增加；低劑量組、中劑量組及高劑量組大鼠肺部均呈一定程度的組織水腫和炎癥浸潤，但嚴重程度均不及膿毒癥組，各組肺病理評分均低于膿毒癥組，中劑量組及高劑量組大鼠肺組織炎癥改變程度和肺病理評分較低劑量組進一步降低，見圖4C~E。

Figure 2.Carbazochrome sodium sulfonate（Car）alleviated the effusion and consolidation in the lung of septic rats.A：sham group；B：sepsis group，the lung of septic rats had presented the effusion and consolidation（red arrow），as evidenced by CT scanning；C：Car（8 mg/kg）group；D：Car（40 mg/kg）group）；E：Car（80 mg/kg）group.圖2 卡絡磺鈉減輕膿毒癥大鼠肺滲出和肺不張

Figure 3.Carbazochrome sodium sulfonate（Car）decreased the pulmonary vascular permeability in septic rats.Mean±SD.n=8.#P<0.05 sham grouup；**P<0.01 vs sepsis group.圖3 卡絡磺鈉對膿毒癥大鼠肺血管通透性的影響

5 卡絡磺鈉對膿毒癥大鼠肺組織凋亡的影響

如圖5所示，與假手術組相比，膿毒癥大鼠肺組織的凋亡指數顯著升高（P<0.01）；卡絡磺鈉低劑量、中劑量和高劑量組大鼠肺組織的凋亡指數均低于膿毒癥組，且中、高劑量組大鼠肺組織的凋亡指數較低劑量組進一步降低（P<0.01）。

6 卡絡磺鈉對膿毒癥大鼠的肺組織中parkin和LC3表達的影響

如圖6所示，與假手術組相比，膿毒癥大鼠肺組織中parkin的表達顯著增多（P<0.05），自噬水平標志物LC3-II/LC3-I比值顯著升高（P<0.05）；卡絡磺鈉組大鼠肺組織中parkin表達及LC3-II/LC3-I比值與膿毒癥組相比均顯著降低（P<0.05），且上述改變具有藥物濃度依賴趨勢。

7 卡絡磺鈉對膿毒癥大鼠肺組織中線粒體自噬水平的影響

免疫熒光結果顯示，假手術組大鼠肺組織parkin熒光強度較弱（紅色熒光），parkin與Tom20（線粒體外膜標志物）共染熒光（黃色熒光）也較弱；膿毒癥大鼠肺組織parkin熒光及parkin與Tom20共染熒光較假手術組均顯著增強；而與膿毒癥大鼠相比，卡絡磺鈉干預組大鼠肺組織的parkin熒光強度及parkin與Tom20共染熒光強度均減弱，這種變化呈一定的劑量依賴性，見圖7A。此外，假手術組大鼠肺組織LC3熒光強度較弱（紅色熒光），LC3與Tom20共染熒光（黃色熒光）也較弱；膿毒癥大鼠肺組織LC3熒光及LC3與Tom20共染熒光較假手術組均顯著增強；而與膿毒癥大鼠相比，卡絡磺鈉干預組大鼠肺組織的LC3熒光強度及LC3與Tom20共染熒光強度均明顯減弱，這種變化呈一定的劑量依賴性，見圖7B。

Figure 4.Carbazochrome sodium sulfonate（Car）alleviated the pathological injury in lung tissues of the septic rats（HE staining，scale bar=50μm）.A：sham group；B：sepsis group；C：Car（8 mg/kg）group；D：Car（40 mg/kg）group；E：Car（80 mg/kg）group.Mean±SD.n=8.#P<0.05 vs shamgroup；**P<0.01 vs sepsisgroup.圖4 卡絡磺鈉減輕膿毒癥大鼠肺組織的病理損傷

Figure 5.Carbazochrome sodium sulfonate（Car）reduced sepsis-induced apoptosis in the lung tissue of rats（TUNEL staining，scale bar=100μm）.Mean±SD.n=8.##P<0.01 vs sham group；**P<0.01 vs sepsis group.圖5 卡絡磺鈉對膿毒癥大鼠肺組織凋亡的影響

Figure 6.Carbazochrome sodium sulfonate（Car）increased the autophagic level in lung tissue of the septic rats.The expression of parkin and LC3 in the lung tissue of rats in each group was detected by Western blot.Mean±SD.n=8.##P<0.01 vs sham group；**P<0.01 vs sepsisgroup.圖6 卡絡磺鈉對膿毒癥大鼠肺組織中線粒體自噬相關分子的影響

討 論

本研究表明，卡絡磺鈉可以提高膿毒癥大鼠的生存率，證實了卡絡磺鈉對膿毒癥具有保護作用，且具有劑量依賴性。進一步研究結果顯示，卡絡磺鈉可以減輕膿毒癥大鼠肺損傷時出現的肺毛細血管滲漏，改善膿毒癥大鼠急性肺損傷的病理特征性改變、減少細胞凋亡。由此可見在CLP致膿毒癥模型，卡絡磺鈉可以對急性肺損傷產生保護作用，且該保護作用具有一定的劑量依賴性。

卡絡磺鈉是一種毛細血管穩定劑，已被廣泛用于毛細血管脆弱性引發的出血的治療。在一個成人呼吸窘迫綜合征的實驗模型中，卡絡磺鈉已經被報道可以降低肺血管通透性的增加以及減少由于碘克沙酸誘導而導致的動脈氧分壓的降低［9］。我們的研究結果與上述研究相一致，卡絡磺鈉降低了膿毒癥引起的肺血管高通透性，改善了肺的氧合功能。除肺組織外，卡絡磺鈉被證實同樣可以減輕膀胱、前列腺、盆腔、關節腔等器官或組織發生病變時的血管高通透性，從而達到保護器官功能的作用［13-16］。創傷、感染和應激等因素打擊機體時，機體內可產生大量血管活性物質，比如凝血酶，緩激肽和組胺等，引起血管內皮細胞中的磷脂酰肌醇水解和蛋白激酶C（protein kinase C，PKC）活化，進一步激活細胞內的三磷酸肌醇（inositol triphosphate，IP3）受體而造成細胞內鈣離子濃度升高和鈣黏蛋白的降解，最終導致內皮細胞間隙形成、血管通透性增加。而卡絡磺鈉可以抑制磷酸肌醇的水解，抑制細胞內鈣離子濃度的升高和PKC激活，從而降低血管內皮通透性，減輕肺水腫的形成［17］。

線粒體自噬在維持線粒體穩態中發揮著重要作用［18］。研究證實，通過線粒體自噬清除損傷線粒體，可以減少活性氧簇（reactive oxygen species，ROS）產生，減輕肺損傷的發生［19］。然而，線粒體自噬程度過強反而對機體有害，降低線粒體自噬可以減輕肺損傷［20］。我們的研究同樣發現，CLP膿毒癥大鼠肺組織中LC3-II/LC3-I比值升高，LC3與線粒體共定位增強，提示膿毒癥引起肺組織線粒體自噬水平增強。該發現預示線粒體自噬過度增強可能并沒有維持正常的線粒體功能和細胞穩態，反而促使了膿毒癥肺損傷的發生。這與既往研究相一致［7，20］。而卡絡磺鈉干預后，膿毒癥大鼠肺組織中自噬水平，尤其線粒體自噬強度，均明顯下降，且呈一定的濃度依賴性。因此我們的研究證實卡絡磺鈉可以降低膿毒癥大鼠肺組織中的線粒體自噬水平，抑制線粒體自噬過度激活，從而維持肺上皮中線粒體的功能，減輕膿毒癥肺損傷。

Figure 7.Carbazochrome sodium sulfonate（Car）inhibited parkin-mediated mitophagy pathway in lung tissues of the septic rats（n=8，scale bar=50μm）.A：immunofluorescence showing the co-localization of parkin（red）and Tom20（green）；B：immu?nofluorescence showing the co-localization of LC3（red）and Tom20（green）.圖7 卡絡磺鈉對膿毒癥大鼠肺組織中parkin介導的線粒體自噬通路的影響

由parkin介導的線粒體自噬是線粒體自噬經典通路之一。當線粒體發生損傷，線粒體膜電位發生去極化，進而招募胞漿中的parkin分子與受損線粒體膜表面相結合，從而介導線粒體自噬發生［21］。膿毒癥引起肺組織中parkin表達增多，線粒體自噬水平增強；敲除或沉默parkin基因后，肺組織的線粒體自噬水平明顯降低，從而使膿毒癥導致的肺損傷明顯減輕，因此parkin介導的線粒體自噬過度增強是膿毒癥肺損傷的機制之一［7］。抑制或降低該通路的活性，可以減輕膿毒癥引起的肺損傷。我們的研究同樣顯示，膿毒癥大鼠肺組織中parkin蛋白表達顯著增多。進一步的免疫熒光顯示，parkin與線粒體標志物Tom20的共定位熒光在膿毒癥大鼠肺組織中明顯增強。這些結果表明，膿毒癥肺損傷發生時，par?kin介導的線粒體自噬水平明顯增強。而卡絡磺鈉干預后，膿毒癥大鼠肺組織中parkin的表達減少，parkin與Tom20的共定位明顯減弱。該結果證實，卡絡磺鈉可以抑制膿毒癥大鼠肺組織中parkin介導的線粒體自噬過度激活。這可能是卡絡磺鈉減輕膿毒癥肺損傷的機制之一。

綜上所述，卡絡磺鈉通過減少肺毛細血管滲漏，減輕肺組織細胞凋亡和病理損傷，從而減弱肺損傷程度，提高膿毒癥大鼠生存率。卡絡磺鈉減輕膿毒癥肺損傷的機制可能與其抑制parkin介導的線粒體自噬過度激活有關。