抑制miR-9通過上調FoxG1改善顳葉癲癇中Wnt/β-catenin通路異常導致的學習記憶障礙

文若劍 陳曉青 田香

(江漢大學醫學院 1生理教研室，湖北 武漢 430056；2藥理教研室；3武漢生物醫學研究院)

癲癇主要表現為大腦內神經元的異常興奮導致的反復、突然抽搐。癲癇是常見的神經系統疾病之一，與多種神經認知障礙相關，聯合發病會大大提高致死率〔1，2〕。長期、頻繁的癲癇持續狀態(SE)可導致急性和持久的中樞神經系統損傷及海馬神經元損傷，從而導致持久性的認知功能障礙〔3〕。關于癲癇中伴隨著認知功能障礙的主要原因集中在神經元樹突棘丟失上，而癲癇中Wnt/β-catenin通路異常可能是導致該損傷的主要原因，同時Wnt/β-catenin通路也是對急性和慢性癲癇都能有效治療的分子靶點。顳葉癲癇發病率占所有癲癇的25%，臨床上針對該種癲癇類型病人的多種抗癲癇藥物的療效并不理想〔4，5〕。因此，控制和減少SE后神經元損傷及抑制難治性癲癇的發生具有重要臨床意義。研究表明，Fox轉錄因子家族的一員又頭框G1基因(FoxG1)的功能異常會引起一系列大腦發育疾病障礙，以嚴重的智力障礙、語言能力缺失、自閉癥行為、運動功能異常及癲癇為特征〔6〕。而且有研究證明在肝癌細胞中FoxG1會通過Wnt/β-catenin通路促進上皮細胞間質化〔7〕。那么癲癇后的認知功能障礙很有可能是由于FoxG1介導的Wnt/β-catenin通路異常，可以通過干預FoxG1來改善癲癇后的認知功能障礙。微小RNA(miRNA)是一類由內源基因編碼的長度約為22個核苷酸的非編碼單鏈RNA分子，它們在動植物中參與轉錄后基因表達調控〔8〕。因此，通過miRNA來調控目的基因的表達從而影響疾病的病理進程是一個有效的手段。有研究表明，miR-9可以通過調節多種轉錄因子的表達來控制前體細胞的增殖與分化〔9〕，核受體蛋白(Nr2e1)、抑制元素1-沉默轉錄因子(REST)、REST輔助抑制因子(CoREST)、肌動蛋白樣蛋白6A抗體(BAF53a)與FoxG1均為miR-9的調控底物〔10～12〕。那么通過miR-9對于FoxG1的調控來改善癲癇中Wnt/β-catenin通路異常導致認知功能障礙，可能是一個潛在的有效治療方式。本研究旨在探討該途徑在顳葉癲癇后學習記憶功能障礙的機制。

1 材料和方法

1.1實驗動物癲癇造模及評級標準 動物飼養：C57BL/6小鼠(3月齡)66只，體重24～26 g，飼養于23℃±2℃，12 h晝夜燈光交替獨立通風籠具系統(IVC)動物房，高壓滅菌水食，自由進食飲水。

18只實驗鼠隨機分為對照組(n=3)和實驗組(n=15)，實驗組又分為1、7、14、30、60 d 5組，每組3只小鼠。實驗組進行模型制備：以20 mg/kg的劑量腹腔注射海人藻酸，注射后連續觀察5 h小鼠的行為。當小鼠癲癇持續發作抽搐達1 h，以4 mg/kg的劑量腹腔注射地西泮終止癲癇發作。若未能緩解癲癇發作，可重復適量腹腔注射地西泮1～2次，直到癲癇發作終止。對照組同樣腹腔注射的方式給予生理鹽水(35 μl/g)以取代海人藻酸，其余的用藥、步驟及方法同海人藻酸組一致。癲癇性發作按Racine分級標準進行判定：0級，無抽搐發作；Ⅰ級，耳、面部抽搐；Ⅱ級，肌陣攣，但無直立位；Ⅲ級，肌陣攣，伴直立位；Ⅳ級，全身強直陣攣發作；Ⅴ級，強直陣攣發作，并失去體位控制。以出現持續1 h的Ⅲ級以上的發作，并在解除癇性發作后狀態良好的小鼠為癲癇持續狀態模型成功鼠。

1.2RNA提取與熒光實時定量PCR 癲癇造模后取對照組和實驗組不同時間點(1 d、7 d、14 d、30 d、60 d)小鼠海馬組織提取RNA進行qRT-PCR檢測FoxG1、Wnt3和β-catenin的表達情況。取小鼠的大腦海馬組織，液氮快速研磨后，采用Trizol(Invitrogen)法提取總RNA，利用分光光度計測量所提RNA的濃度與純度。使用FSQ-401 ReverTra Ace qPCR RT Master Mix with gDNA Remove試劑盒進行逆轉錄，用于FoxG1、Wnt3、β-catenin的檢測。按照說明使用Roche的PCR系統進行擴增，采用ΔΔCT 法分析。GAPDH為FoxG1、Wnt3、β-catenin的內參。FoxG1正向引物：5′-TGGCCCATGTCGCCCTTCCT-3′；FoxG1反向引物：5′-GCCGACGTGGTGCCGTTGTA-3′；Wnt3正向引物：5′-CTGCCAGGAGTGTATTCGCATC-3′；Wnt3反向引物：5′-GAGAGCCTCCCCGTCCACAG-3′；β-catenin正向引物：5′-TCTGAGGACAAGCCACAAGATTACA-3′；β-catenin反向引物：5′-TGGGCACCAATATCAAGTCCAA-3′；GAPDH正向引物：5′-TATGATGATATCAAGAGGGTAGT-3′；GAPDH反向引物：5′-TGTATCCAAACTCATTGTCATAC-3′。

1.3立體定位注射 48只小鼠隨機分配到Con組(n=16)、EGFP組(n=16)、miR-9 Sponge組(n=16),經腦立體定位注射后每組各取8只進行水迷宮檢測，各組剩余小鼠進行條件性恐懼實驗。將6%水合氯醛以6 ml/kg的劑量緩慢腹腔注射，麻醉小鼠并隨時注意小鼠的呼吸狀態等。將小鼠的門齒固定于腦定位儀上頜固定器，然后調整兩側耳棒對準動物的外道，使動物的頭在處于兩滑道正中，保持兩個耳棒的刻度一致，然后將兩耳棒上的固定螺絲扭緊，再將牙齒固定器上壓鼻環壓下后扭緊，保證從不同方向推壓動物頭部均不會出現移動。接下來剪去動物頭部毛，用2%碘酒及75%酒精棉球作頭部皮膚的消毒，沿矢狀縫作一約0.8 cm長的皮膚切口，分離皮下組織，使用棉簽擦拭，推開骨膜，暴露前囟、人字縫及矢狀縫。然后將腦袋定位達到平衡狀態。用定位針在前囟后2.1 mm，矢狀縫旁開1.3 mm處定位一點，即為海馬的平面位置，然后在此點上用鉆孔針在顱骨上鉆一小圓孔。小鼠海馬DG則位于該圓孔下2 mm。使用微量注射器吸入實驗組病毒AAV-CamkII-miR-9-sponge-EGFP或者對照病毒AAV-CamkII-EGFP(Genechem)后，安置到微量注射泵上，使注射器針頭由小鼠腦鉆孔處下降2 mm時，開始病毒注射。以50 nl/min的速度注射2 μl，隨后待注射停止后原位置留針5 min，然后上移1 mm，繼續留針5 min。拔針后使用2% 碘酒及75% 酒精棉球給頭部皮膚消毒，然后縫皮。

1.4行為學檢測 水迷宮檢測：實驗開始前將實驗小鼠放入水迷宮房間適應環境3 h。實驗所采用的檢測系統為高60 cm，直徑長120 cm的圓柱形水池；高40 cm，直徑長10 cm的圓柱形有機玻璃平臺；水池上空安裝有攝像機并與計算機相連記錄小鼠在水迷宮中的活動。在水池內放水至高出平臺表面約0.5 cm，室溫及水溫均保持在(25±2)℃。在水中加入鈦白粉以便于記錄小鼠(黑鼠)的運動軌跡。在水池四周設置固定圖形以便于小鼠識別方位。設置實驗總時長90 s，記錄小鼠每次從入水點至到達平臺所需時間(潛伏期)及在該潛伏期內的運動速度和運動軌跡。訓練時使小鼠頭向水池壁從固定點(任一象限1/2弧度處)沿筒壁輕輕放入水中，從小鼠入水時刻立即開始記錄小鼠的運動軌跡，至小鼠找到隱蔽平臺為時間終點，記為潛伏期。設置定位航行實驗總時長為90 s，若小鼠未在該時間段內找到平臺，則計算機系統停止追蹤記錄，并記錄潛伏期為90 s。沒有找到平臺的小鼠將被人為引導至平臺，停留20 s。每只小鼠每天在3個象限分別訓練1次，共3次，每次訓練結束后休息30 min，連續訓練7 d。每天保持隔音實驗房間內的環境條件不變。

場景依賴條件性恐懼記憶檢測：整個實驗周期共有3天。第1天為訓練階段，實驗前先用一只非實驗小鼠測試電流刺激強度。測試正常后，將實驗小鼠置于條件恐懼通電柵欄底板實驗箱中開始實驗。實驗適應期為4 min，使小鼠在方形箱內自由活動，同時記錄小鼠的基礎水平僵直的百分比。適應期結束后立即給予小鼠一個長達2 s，強度為1 mA的足底電刺激，隨后進入58 s的休息段。每只小鼠實驗結束后均需用70%乙醇擦拭箱內各壁，氣味散盡后檢測下一只。第2天是檢測情景關聯(Context)的恐懼記憶，實驗開始后將小鼠放入與第1天相同的試驗箱中自由活動5 min，記錄小鼠的僵直百分比。然后變更場景(Altered content)測試，實驗開始前將場景更換為四周貼滿黑白條紋紙、箱底部為平滑模板的新方箱(Content B)，實驗中將小鼠置于新實驗箱中自由活動5 min，記錄小鼠的僵直百分比。測試系統對僵直行為進行評分來測量該階段的恐懼記憶。

1.5統計學方法 使用Graphpad 軟件進行統計學分析作圖，多組之間采用單因素方差分析組間差異，兩組之間采用t檢驗。

2 結 果

2.1FoxG1與Wnt/β-catenin通路在癲癇后時間序列表達呈正相關 造模不同時間β-catenin相對表達水平呈下調趨勢，Wnt3的相對表達水平也下調；而且顳葉癲癇后FoxG1的表達與Wnt/β-catenin通路相一致，并且均在癲癇發作后第14天達到最低峰，且FoxG1的表達下調是持續的，先于Wnt/β-catenin通路異常，結果表明，FoxG1與Wnt/β-catenin通路的表達在顳葉癲癇中呈正相關。見表1。

表1 造模不同時間小鼠β-catenin、Wnt3、FoxG1表達比較

2.2抑制miR-9通過上調FoxG1改善癲癇中Wnt/β-catenin通路異常 miR-9-Sponge組FoxG1、Wnt、β-catenin水平均顯著高于EGFP組(P<0.05)。見表2。表明miR-9在小鼠DG抑制之后，通過上調FoxG1的表達來改善顳葉癲癇中Wnt/β-catenin通路表達異常。

表2 EGFP組和miR-9 Sponge組β-catenin、Wnt3、FoxG1表達比較

2.3抑制miR-9改善癲癇后小鼠的學習記憶障礙 miR-9 Sponge組相對于EGFP組的空間學習能力明顯提升，恢復至于Con組同等水平；相較于EGFP組，miR-9 Sponge組小鼠的空間記憶能力也明顯提升恢復至正常水平；恐懼記憶檢測中，EGFP組在癲癇造模后也表現出明顯的記憶障礙，在小鼠海馬齒狀回抑制miR-9之后有顯著的改善。見表3、表4。

表4 各組恐懼記憶能力、空間記憶能力比較

3 討 論

FoxG1是一個具有廣泛生物學影響的轉錄抑制因子，可調節大腦腹側-背側的模式〔13〕，在Cajal-Retzius細胞中非常重要，可以抑制膠質細胞的增生和促進神經新生〔14〕。前腦FoxG1的過表達可導致神經上皮細胞增厚，這可能是導致神經上皮細胞凋亡的主要原因〔15〕。但是FoxG1表達異常導致癲癇的原因尚不清楚。Wnt/β-catenin信號通路可能是癲癇疾病中急性和慢性期均適用的一個潛在的治療靶標〔16〕。Wnt/β-catenin通路可參與調節許多癲癇導致的大腦的變化，包括神經新生、神經細胞死亡，同時也可以影響癲癇的發作及癲癇慢性期的發展。有研究證明癲癇與Wnt/β-catenin信號通路異常密切相關〔17〕。本實驗結果表明，抑制miR-9后明顯改善了顳葉癲癇后小鼠的空間學習記憶能力障礙及場景依賴性的恐懼記憶缺陷。綜上所述，抑制miR-9可通過上調FoxG1的表達來改善癲癇中Wnt/β-catenin信號通路異常，從而改善顳葉癲癇后小鼠的學習記憶障礙，為顳葉癲癇的臨床控制與治療提供了新的思路與靶標。