長鏈非編碼RNA LINC00467靶向miR-1247-5p調控肝癌細胞增殖、遷移及侵襲的影響

李豪 姬發祥 徐曉寧 馬金華 沈存芳 李進章 王麗娟

(青海大學附屬醫院腫瘤內科，青海 西寧 810000)

肝癌發病率及死亡率較高，臨床治療過程中主要采用手術治療，但術后患者復發轉移率逐年升高〔1〕。因而探討肝癌細胞增殖、遷移及侵襲的作用機制是提高肝癌治療效果的關鍵。長鏈非編碼RNA(lncRNA)可參與癌癥、心血管疾病等生理病理過程并可發揮重要調控作用〔2〕。lncRNA LINC00467在神經母細胞瘤及結腸癌中高表達，并可促進結腸癌的遷移和侵襲〔3，4〕。LINC00467還可促進肺腺癌細胞增殖和血管生成，且與腫瘤大小和血管侵犯等因素密切相關〔5〕。通過生物信息學軟件預測LINC00467可吸附微小RNA-1247-5p(microRNA-1247-5p，miR-1247-5p)進而抑制其表達，研究顯示miR-1247在胰腺癌組織中下調表達，miR-1247過表達可抑制胰腺癌細胞的增殖〔6〕。miR-1247在胃癌組織及細胞中均呈低表達，上調miR-1247表達可抑制胃癌細胞增殖及遷移〔7〕。近來研究顯示miR-1247-5p可在肝癌發生及發展過程中發揮抑癌基因作用，并可能通過調控Wnt3表達進而抑制肝癌細胞增殖及遷移〔8〕。但LINC00467在肝癌中的表達研究及其是否通過調控miR-1247-5p的表達影響肝癌細胞增殖、遷移、侵襲目前尚未可知。本研究通過檢測LINC00467在肝癌細胞中的表達，初步探究LINC00467對肝癌細胞增殖、遷移及侵襲的作用機制。

1 材料與方法

1.1材料與試劑 人不同肝癌細胞HepG2、SMMC-7721、BEL-7402及正常肝細胞株L02均購自中國科學院上海細胞生物研究所細胞庫。DMEM、胎牛血清與胰蛋白酶均購自美國Gibco公司；Transwell小室與基質膠均購自美國Corning公司；LINC00467過表達質粒購自吉凱公司；Lipofectamine?2000轉染試劑購自美國Invitrogen公司；siRNA、miR-1247-5p mimic、miR-1247-5p抑制劑及其各自陰性對照均購自廣州銳博生物科技有限公司；Trizol、miScriptⅡRTKit反轉錄試劑盒及實時熒光定量(qRT-PCR)試劑盒均購自美國Promega公司；噻唑藍(MTT)試劑盒購自碧云天生物科技有限公司；細胞周期蛋白(Cyclin)D1、p21、p27、基質金屬蛋白酶(MMP)-2、MMP-9、MMP-14抗體均購自美國Cell Signaling Technology公司。

1.2細胞轉染及分組 不同肝癌細胞及正常肝細胞均培養于DMEM培養基，所用培養基含有100 ml/L胎牛血清，放置在溫度為37℃、體積分數為5%CO2培養箱，將生長良好的HepG2細胞以每孔1.5×105個細胞的密度接種于6孔細胞板，用對照序列(si-NC)與si-LINC00467進行細胞轉染，分別為si-NC組、si-LINC00467組；用miR-NC與miR-1247-5p mimic轉染細胞，分別為miR-NC組、miR-1247-5p組；用LINC00467過表達質粒及其空載質粒轉染細胞，分別為pcDNA-LINC00467組、pcDNA組；用anti-miR-1247-5p與anti-miR-NC轉染si-LINC00467組細胞，分別為si-LINC00467+anti-miR-1247-5p組、si-LINC00467+anti-miR-NC組。所有操作需嚴格按照Lipofectamine?2000轉染試劑盒說明書操作，轉染12 h后更換新鮮培養基，繼續培養48 h后收集各組對數生長期細胞用于后續實驗。

1.3qRT-PCR檢測細胞中 LINC00467、miR-1247-5p表達水平 LINC00467、miR-1247-5p相對表達量檢測均需采用Trizol法提取各組細胞總RNA，參照反轉錄試劑盒將RNA反轉錄為cDNA，以cDNA為模板進行qRT-PCR，所有引物序列由華大基因生物科技有限公司設計合成。qRT-PCR條件為95℃ 5 min，循環1次，95℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，重復循環數為40次。收集各孔閾值(Ct)，LINC00467、miR-1247-5p均以U6為內參基因，采用2-ΔΔCt法計算LINC00467、miR-1247-5p相對表達量。

1.4Western印跡檢測CyclinD1、p21、p27、MMP-2、MMP-9、MMP-14蛋白表達 按照1.2分別處理細胞后，加入RIPA裂解液裂解細胞，30 min后12 000 r/min離心10 min(溫度為4℃)，收集上清并采用二喹啉甲酸(BCA)法測定蛋白濃度，取50 μg蛋白進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離蛋白，電泳反應分為積層膠(80 V 40 min)與分離膠(120 V 1.5 h)，電泳結束后將分離的蛋白凝膠轉移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，室溫封閉1 h后分別加入各蛋白一抗(稀釋比1∶500)，置于4℃冰箱內孵育過夜，TBST洗膜后分別加入二抗(1∶5 000)，室溫孵育1 h后TBST洗膜，電化學發光法(ECL)顯影并曝光，放入凝膠成像分析系統并應用Scion Image軟件分析各蛋白條帶灰度值。

1.5熒光素酶報告基因檢測 通過生物信息學軟件預測miR-1247-5p在LINC00467上的結合位點，采用PCR擴增此結合位點，將擴增片段插入pMIR-REPORT載體構建LINC00467野生型質粒(WT-LINC00467)；采用基因突變技術結合位點進行突變，構建LINC00467突變型質粒( MUT-LINC00467)。分別將WT-LINC00467、MUT-LINC00467與miR-1247-5p mimic共轉染細胞，采用熒光素酶檢測試劑盒檢測各組細胞熒光素酶活性。

1.6MTT檢測細胞增殖 將各組對數生長期HepG2細胞接種于96孔細胞培養板(1×103個細胞/孔)，每組設置6個復孔，分別于培養24、48、72 h向每孔分別加入濃度為5 mg/ml的MTT溶液10 μl，室溫孵育4 h，棄上清，每孔分別加入二甲基亞砜(DMSO)150 μl，振蕩充分混勻后置于酶標儀檢測各組在波長為490 nm處的光密度(OD)值。

1.7Transwell實驗檢測細胞遷移及侵襲 取各組對數生長期HepG2細胞，不含胎牛血清DMEM培養基重懸細胞(密度為5×104)，取200 μl細胞懸浮液加入Transwell小室的上室，取500 μl含胎牛血清DMEM培養基加入Transwell小室的下室，孵箱內培養24 h后棄上層培養液，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌，用多聚甲醛(4%)固定20 min，用棉簽除去上層液體，結晶紫染色，10 min后用PBS洗滌，置于顯微鏡下隨機選取5個視野拍照并計算遷移細胞數，實驗重復3次。細胞侵襲實驗：按照1∶8比例用不含胎牛血清DMEM培養基稀釋基質膠，基質膠鋪于Transwell小室上室，按80 μl/孔密度包被Transwell小室底部膜，其余步驟同細胞遷移實驗。每組實驗均設置3次重復。

1.8統計學處理 應用SPSS21.0軟件進行t檢驗、單因素方差分析。

2 結 果

2.1LINC00467和miR-1247-5p在肝癌細胞和正常肝細胞中的表達 不同肝癌細胞株HepG2、SMMC-7721、BEL-7402中LINC00467相對表達量明顯高于正常肝細胞株L02(P<0.05)，而miR-1247-5p相對表達量明顯降低(P<0.05)，見表1。

表1 LINC00467和miR-1247-5p在肝癌細胞和正常肝細胞中的表達

肝癌HepG2細胞中LINC00467相對表達量最高，miR-1247-5p相對表達量最低，因此后續研究中將以肝癌HepG2細胞為主要研究材料。

2.2抑制LINC00467表達對肝癌HepG2細胞增殖的影響 Western印跡檢測結果發現si-LINC00467組LINC00467相對表達量明顯低于si-NC組(P<0.05)，48 h與72 h時HepG2細胞OD值明顯低于si-NC組(P<0.05)，見表2。si-LINC00467組HepG2細胞中CyclinD1蛋白表達較si-NC組顯著下調(P<0.05)，而p21與p27蛋白表達顯著上調(P<0.05)。見圖1，表3。

表2 抑制LINC00467表達對肝癌HepG2細胞增殖的影響

圖1 增殖相關蛋白表達

表3 抑制LINC00467表達對肝癌HepG2細胞增殖相關蛋白表達的影響

2.3抑制LINC00467表達對肝癌HepG2細胞遷移、侵襲的影響 Transwell實驗結果顯示抑制LINC00467表達后，HepG2細胞遷移及侵襲數較si-NC組明顯降低(P<0.05)，Western印跡檢測結果顯示，si-LINC00467組HepG2細胞中MMP-2、 MMP-9、MMP-14蛋白表達相較于si-NC組明顯降低(P<0.05)，見圖2、圖3、表4。

圖2 遷移、侵襲相關蛋白表達

圖3 肝癌HepG2細胞的遷移、侵襲(結晶紫染色，×200)

2.4miR-1247-5p過表達對肝癌HepG2細胞增殖、遷移、侵襲的影響 qRT-PCR檢測顯示，miR-1247-5p組miR-1247-5p表達水平明顯高于miR-NC組(P<0.05)。MTT檢測結果顯示miR-1247-5p組48、72 h HepG2細胞OD值明顯降低(P<0.05)；Transwell實驗結果顯示miR-1247-5p組HepG2細胞遷移及侵襲數均明顯降低(P<0.05)；Western印跡顯示miR-1247-5p組HepG2細胞中CyclinD1、MMP-2、MMP-9蛋白表達均明顯降低(P<0.05)，而p21蛋白表達明顯升高(P<0.05)，見表5，表6，圖4。

表6 miR-1247-5p過表達對肝癌HepG2細胞增殖、遷移、侵襲相關蛋白表達的影響

圖4 miR-1247-5p過表達的增殖、遷移侵襲相關蛋白表達

2.5LINC00467靶向調控miR-1247-5p的表達 通過生物信息預測顯示LINC00467上存在miR-1247-5p的結合位點(圖5)，采用熒光素酶報告實驗驗證LINC00467與miR-1247-5p的靶向關系，結果顯示miR-1247-5p mimic可顯著降低WT-LINC00467熒光素酶活性(P<0.05)，結合位點突變后miR-1247-5p mimic對LINC00467質粒熒光素酶活性無明顯影響(P>0.05)，見表7。Western印跡檢測結果顯示，相較于si-NC組(1.01±0.09)，si-LINC00467組miR-1247-5p表達水平(3.16±0.28)明顯升高(P<0.05)；相較于pcDNA組(1.03±0.08)，pcDNA-LINC00467組miR-1247-5p表達水平(0.34±0.04)明顯降低(P<0.05)。

2.6抑制miR-1247-5p表達逆轉了抑制LINC00467表達對肝癌HepG2細胞增殖、遷移、侵襲的作用 與si-LINC00467+anti-miR-NC組相比，qRT-PCR顯示si-LINC00467+anti-miR-1247-5p組HepG2細胞中miR-1247-5p相對表達量明顯降低(P<0.05)；MTT檢測顯示HepG2細胞48、72 h OD值、遷移及侵襲細胞數均明顯增加(P<0.05)；Western印跡檢測顯示HepG2細胞中CyclinD1、MMP-2、MMP-9蛋白表達均明顯升高(P<0.05)，而p21蛋白表達明顯降低(P<0.05)，見圖6，表8，表9。

圖5 LINC00467的序列中含有與miR-1247-5p互補的核苷酸序列

表7 雙熒光素酶報告實驗

1～4：si-NC組、si-LINC00467組、si-LINC00467+anti-miR-NC組、si-LINC00467+anti-miR-1247-5p組圖6 抑制miR-1247-5p的增殖、遷移侵襲相關蛋白表達

3 討 論

肝癌具有惡性程度高等特點，由于肝癌細胞增殖、遷移及侵襲的機制尚未完全闡明導致肝癌進展快及復發轉移率高〔9〕。研究顯示肝癌發生及發展過程中lncRNA發揮重要作用〔10〕。隨著現代生物技術的進步，從分子水平上尋找新型分子標志物及肝癌治療靶點成為新方向。

LINC00467在結直腸癌、肺癌等多種惡性腫瘤中呈高表達并可促進腫瘤細胞增殖及遷移，并可能作為臨床早期診斷及評估患者預后的重要分子標志物〔11～13〕。然而，LINC00467在肝癌中的作用研究鮮有報道，本研究結果說明LINC00467表達水平升高可能是誘導肝癌發生的原因之一，提示LINC00467可能通過調控某些基因轉錄后水平進而發揮促癌作用。研究表明LINC00467在非小細胞肺癌細胞中呈高表達并可促進細胞增殖及侵移轉移，沉默LINC00467表達可抑制癌細胞惡性增殖并可為靶向治療非小細胞肺癌提供潛在靶點〔14,15〕。本研究結果表明抑制LINC00467表達后肝癌HepG2細胞增殖活性明顯降低，細胞增殖相關蛋白CyclinD1蛋白表達明顯降低，而p21與p27蛋白表達明顯升高，其中CyclinD1能夠與細胞周期依賴性蛋白結合并促使細胞核轉錄因子從細胞質進入細胞核進而促進細胞增殖，p21與p27可抑制CyclinD1與細胞周期依賴性蛋白結合并誘導細胞周期阻滯進而抑制細胞增殖〔16〕。提示沉默LINC00467表達可能通過上調p21、p27蛋白表達并抑制CyclinD1蛋白表達進而抑制肝癌細胞增殖。Transwell細胞遷移及侵襲實驗結果表明，腫瘤細胞遷移及侵襲的物質基礎是細胞外基質降解，MMP-2激活后可促進MMP-9、MMP-14活化進而促進腫瘤細胞遷移及侵襲過程〔17〕。說明抑制LINC00467表達可能通過抑制MMP-2、MMP-9、MMP-14活化進而降低肝癌細胞遷移及侵襲能力。提示肝癌細胞中LINC00467表達水平升高可通過調節細胞增殖、遷移及侵襲蛋白表達而發揮癌基因作用。

原發性肝癌患者血清中miR-1247-5p表達水平顯著降低，并可能作為肝癌早期診斷的重要指標〔18〕。乳腺癌患者組織及細胞中miR-1247-5p均呈低表達并與患者預后不良密切相關，上調miR-1247-5p表達可能通過調控DVL1/Wnt/β-catenin信號通路進而抑制腫瘤細胞生長，同時miR-1247-5p還與去勢抵抗性前列腺癌發生及發展密切相關〔19,20〕。本研究結果提示上調miR-1247-5p 表達可通過抑制CyclinD1、MMP-2、MMP-9蛋白表達并上調 p21蛋白表達進而抑制肝癌細胞增殖、遷移及侵襲。雙熒光素酶報告基因檢測顯示LINC00467可靶向調控miR-1247-5p表達即LINC00467可通過競爭性吸附miR-1247-5p從而促使其表達水平降低。為了驗證LINC00467是否通過負向調節miR-1247-5p而發揮作用，本研究將沉默miR-1247-5p表達，將其與LINC00467 siRNA共同轉染入肝癌HepG2細胞，結果提示抑制miR-1247-5p表達逆轉了抑制LINC00467表達對肝癌HepG2細胞增殖、遷移、侵襲的作用。

綜上，肝癌細胞中LINC00467高表達，miR-1247-5p低表達，LINC00467可通過抑制miR-1247-5p表達進而促進肝癌細胞增殖、遷移及侵襲，可為后續深入研究肝癌發生及發展的作用機制提供基礎依據，并可為臨床診斷及治療肝癌提供有效靶點。然而，關于LINC00467競爭性吸附miR-1247-5p并抑制其表達后又是如何調控疾病進展相關信號通路表達仍需深入研究。