甘藍型油菜銨轉運蛋白基因家族成員的鑒定與表達分析

周 婷，岳彩鵬，黃進勇，華營鵬

(鄭州大學 農學院，河南 鄭州 450001)

1 材料和方法

1.1 試驗材料

供試材料為冬油菜品種湘油15，由湖南農業大學官春云院士提供。

1.2 試驗方法

1.2.1 甘藍型油菜AMT家族基因的鑒定 利用擬南芥AMT氨基酸序列為種子序列進行Blast分析，在白菜、甘藍、甘藍型油菜等植物中尋找AMT基因。在本研究中，使用了以下數據庫：擬南芥信息資源數據庫(TAIR)(https：//www.arabidopsis.org/)用于擬南芥氨基酸序列查找，蕓薹屬數據庫(BRAD)v.1.1(http：//brassicadb.org/brad/)[32]用于白菜、甘藍以及甘藍型油菜氨基酸序列搜索。根據以下標準對蕓薹屬植物中的基因進行了命名：種名+染色體+同源基因的名稱。例如，BnaA1.AMT1；4是指甘藍型油菜A1染色體上擬南芥AMT1；4的同源基因。

1.2.2 AMT蛋白的分子特性鑒定 使用ExPASy ProtoParam(http://www.expasy.org/tools/protparam.html)[33]計算了各AMT蛋白的氨基酸數目和組成、分子質量(MW)、理論等電點(pI)、平均親水系數(GRAVY)和不穩定性指數。利用THMMM(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)和TMpred(https：//embnet.vital-it.ch/software/TMPRED_form.html)[34]預測氨基酸序列的跨膜結構域(TM)數目。

1.2.3 AMT家族基因進化樹的構建 利用MEGA 7中的ClustalW功能，對20個甘藍型油菜AMT蛋白序列、6個擬南芥AMT蛋白序列、9個白菜AMT蛋白序列和10個甘藍的AMT蛋白序列進行比對，根據序列比對的結果，采用鄰近法(NJ)構建系統進化樹，Bootstrap值設定為1 000[35-36]。

1.2.4 AMT家族基因的結構分析 為了研究擬南芥和蕓薹屬作物AMT蛋白的結構差異，將所有的AMT蛋白序列置于MEME v5.1.1[37](http://meme-suite.org/tools/meme)中比對，以表征保守結構域。除了下列參數外，其余參數使用默認設置：最佳圖案寬度設置為6～50 bp，最大保守結構域數量設置為10。使用2種不同的工具分析蛋白質的二級結構：GOR4[38](https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgibin/page=npsagor4.html/)和PSIPRED[39](http：//bioinf.cs.ucl.ac.uk/PSIPRED/)。利用在線網站Phyre2[40](http：//www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/html)進行同源建模，以構建蛋白質的三維結構。

1.2.5 AMT家族基因的染色體定位分析 為了確定AMT基因在染色體上的位置和方向，將完整的AMT基因核苷酸序列進行BlastTn搜索，從而確定了AMT基因在每個染色體上的起始位置。使用MapInspect v.2010(http://www.soft.com/./MapInspect.html)作圖，描繪AMT基因的基因組位置。串聯重復基因是指100 kb基因組區域內的2個或更多基因的陣列[41]。

1.2.7 高通量轉錄組測序 對上述脅迫處理(1.2.6)的樣品進行轉錄組測序，測序平臺為Illumina Hiseq 2000，每個樣品生成6.0 Gb測序數據，測序方式為雙末端(PE)測序，讀取長度為150 bp。以錯誤發現率(FDR)≤0.05和表達變化倍數≥2為鑒定差異表達基因的閾值。

1.2.8 組織表達分析 組織表達數據來源于甘藍型油菜轉錄組信息資源數據庫(BnTIR，http：//yanglab.hzau.edu.cn/BnTIR)。數據包括甘藍型油菜中雙11的90個不同樣品，覆蓋了油菜生長過程不同階段的不同器官。利用GraphPad Prism軟件繪制箱型圖。

2 結果與分析

2.1 二倍體白菜與甘藍以及四倍體甘藍型油菜AMT家族基因的鑒定

為了鑒定甘藍型油菜中的AMT基因，使用擬南芥AMT的氨基酸序列作為參照，從蕓薹屬數據庫(BRAD)中提取基因，并用油菜轉錄組數據檢驗這些基因的注釋。進一步用SMART[43]軟件對所有潛在基因所編碼蛋白質的保守結構域進行校驗，以保證每個蛋白質中都含有完整的AMT保守結構域，經過篩選，最終鑒定出20個BnaAMT基因：其中14個為AMT1家族成員：3個BnaAMT1;1s，2個BnaAMT1;2s、3個BnaAMT1;3s、3個BnaAMT1;4s、3個BnaAMT1;5s，其余6個為AMT2亞家族成員BnaAMT2;1s；并基于蕓薹屬植物基因命名標準進行了命名：BnaA5.AMT1；1～BnaCnn.AMT2；1。其中，Cnn表示該基因錨在C亞基因組上，但具體染色體信息未知；Unn表示該基因在油菜基因組的染色體信息完全未知。用同樣的方法找到了白菜和甘藍的AMT家族基因，白菜中共有9個AMT成員，甘藍中共有10個AMT成員。分析了這39個基因所編碼蛋白質的氨基酸數量、分子質量、等電點、不穩定系數、脂肪指數以及平均親水系數。所有AMT基因編碼蛋白質的氨基酸數量為330～669，其中33個介于475～512，差異較小(表1)。不穩定性指數>40表明蛋白質不穩定[44]，分析表明這39個AMT蛋白均為穩定蛋白。

表 1 甘藍型油菜、白菜、甘藍AMT家族基因信息Tab.1 Basic information of AMT family genes in Brassica napus，Brassica rapa and Brassica oleracea

2.2 AMT家族基因系統發育分析

用20個甘藍型油菜BnaAMTs蛋白序列、9個白菜BraAMTs蛋白序列、10個甘藍BolAMTs蛋白序列和6個擬南芥AtAMTs蛋白序列構建系統進化樹。AMT的每個亞家族成員都與擬南芥中的相應同源基因緊密聚集(圖1)，暗示甘藍型油菜AMT家族基因與擬南芥相應同源基因具有相似功能。同時，甘藍型油菜BnaAMTs均與白菜或者甘藍的AMT成簇出現，擬南芥單獨成一個分支(圖1)，這說明甘藍型油菜與白菜和甘藍基因編碼的蛋白質在序列上的相似程度高于擬南芥，親緣關系更近。

2.3 AMT家族基因的染色體定位

通過下載甘藍型油菜AMT基因相關染色體定位信息，利用軟件MapInspect進行染色體定位并進行可視化分析(圖2)。結果顯示，甘藍型油菜的20個AMT基因不均勻地分布在12條染色體上：C4染色體上分布3個(BnaC4.AMT2；1a、BnaC4.AMT2；1b、BnaC4.AMT2；1c)，A1、A5和C3染色體上均分布2個(BnaA1.AMT1；3、BnaA1.AMT1；4、BnaA5.AMT1；1、BnaA5.AMT2；1、BnaC3.AMT1；5a、BnaC3.AMT1；5b)，A4、A7、A9、C1、C6、C7和C8染色體上均分布1個AMT基因(分別是：BnaA4.AMT2；1、BnaA7.AMT1；3、BnaA9.AMT1；2、BnaC1.AMT1；4、BnaC6.AMT1；1、BnaC7.AMT1；4、BnaC8.AMT1；1)。BnaCnn.AMT1；2(僅知定位在C亞基因組，具體染色體信息未知)、BnaUnn.AMT1；3(所在亞基因組和染色體信息未知)和BnaCnn.AMT2；1(僅知定位在C亞基因組，具體染色體信息未知)由于具體位置不詳，無法進行染色體定位。其中，BnaC4.AMT2；1b和BnaC4.AMT2；1c在染色體上的相對位置僅為4 412 bp，推斷它們為串聯重復基因簇。

圖1 甘藍型油菜、白菜、甘藍和擬南芥AMT家族蛋白質的系統進化分析Fig.1 Phylogenetic tree of AMT proteins in Brassica napus， Brassica rapa， Brassica oleracea and Arabidopsis

圖2 甘藍型油菜AMT家族基因在染色體上的分布Fig.2 Chromosomal location of Brassica napus AMT family genes

2.4 多序列比對和保守結構域分析

從分子進化的角度來看，如果氨基酸殘基進化保守，則認為它們在功能上或結構上具有重要意義。序列同源性分析表明，甘藍型油菜與擬南芥AMT蛋白具有高度相似性，表明AMT在異源多倍化過程中是保守的。為了揭示蕓薹屬植物和擬南芥AMT家族基因之間的內在聯系，將45個AMT基因的氨基酸序列提交到MEME網站進行保守基序預測和注釋。MEME分析表明，BnaAMT家族基因編碼的氨基酸序列在蕓薹屬植物中基本含有相同的保守結構域(圖3)，表明它們高度保守。Motif是蛋白質分子中具有特定空間構象和特定功能的結構成分。它是結構域的亞單位，與特定的功能有關，推測具有不同Motif的AMT成員可能在進化和功能上存在差異。如，所有的BnaAMT2；1s基因均沒有Motif1、Motif5和Motif6(圖3)，這可能是AMT2家族功能不同于AMT1家族的結構上的原因。AMT1和AMT2亞家族結構差異巨大，進化的過程中可能分開較早。

圖3 甘藍型油菜AMT家族基因及保守基序分析Fig.3 Diagram of structure of Brassica napus AMT family genes and their conserved Motifs

2.5 AMT家族蛋白的二級與三維結構的預測

BnaAMT蛋白的二級結構預測見圖4。由于多重序列比對顯示，AMT1亞家族和AMT2亞家族序列差異較大(圖3)，分別以BnaA5.AMT1；1和BnaA4.AMT2；1為例進行了二級與三級結構預測。GOR4和PSIPRED的二維結構預測結果相似。AMT家族主要由α-螺旋、延伸鏈與隨機螺旋構成，AMT1家族α螺旋比例高于AMT2家族，而AMT2家族的延伸鏈與隨機螺旋比例高于AMT1家族(圖4)。3D輪廓突出了AMT蛋白的保守結構域，可以直觀看出AMT蛋白結構中的α-螺旋、延伸鏈與隨機螺旋(圖5)。這些結果表明，隨機螺旋和α-螺旋是這些AMT蛋白結構的重要組成部分。

2.6 BnaAMT基因的表達特性分析

2.6.1 BnaAMT基因的組織特異性表達 通過對甘藍型油菜轉錄組信息資源庫中AMT基因的分析，得到17個AMT基因(缺少BnaC3.AMT1；5b、BnaC4.AMT2；1c和BnaCnn.AMT2；1基因，在BnPIR(http：//cbi.hzau.edu.cn/bnapus/)甘藍型油菜泛基因組數據庫中檢索發現，這些基因在中雙11油菜基因組中缺失)在8個組織中的表達數據。結果顯示，不同基因在甘藍型油菜不同器官的表達存在差異，進化樹中處于同一分支的基因表達情況相似。例如，BnaA5.AMT1；1和BnaC6.AMT1；1基因在甘藍型油菜除籽粒外的其他器官中表達量都相對較高，而BnaC8.AMT1；1基因在甘藍型油菜所有器官都處于低表達狀態(圖 6)。根器官中表達較高的基因有BnaA5.AMT1；1、BnaC6.AMT1；1、BnaA9.AMT1；2、BnaA7.AMT1；3和BnaC3.AMT1；5a；莖器官中表達較高的基因有BnaA5.AMT1；1、BnaC6.AMT1；1、BnaA9.AMT1；2、BnaA1.AMT1；4和BnaC7.AMT1；4；葉器官中表達較高的基因有BnaA5.AMT1；1、BnaC6.AMT1；1、BnaA9.AMT1；2、BnaA1.AMT1；4、BnaC7.AMT1；4和BnaA5.AMT2；1；蕾器官中表達較高的基因有BnaA1.AMT1；4、BnaC1.AMT1；4、BnaC7.AMT1；4和BnaC4.AMT2；1b；花器官中表達較高的基因有BnaA5.AMT1；1、BnaC6.AMT1；1、BnaA1.AMT1；4、BnaC1.AMT1；4、BnaC7.AMT1；4、BraA3.AMT1；5和BnaC4.AMT2；1b；角果器官中表達較高的基因有BnaA5.AMT1；1、BnaC6.AMT1；1、BnaA1.AMT1；4和BnaC7.AMT1；4；角果殼器官中表達較高的基因有BnaA5.AMT1；1、BnaC6.AMT1；1、BnaA1.AMT1；4、BnaC7.AMT1；4、BnaA5.AMT2；1和BnaC4.AMT2；1b，籽粒中所有基因均呈低表達狀態(圖 6)。

圖4 甘藍型油菜BnaA5.AMT1；1和BnaA4.AMT2；1蛋白二級結構分析Fig.4 Secondary structure analysis of BnaA5.AMT1；1 and BnaA4.AMT2；1 proteins

圖5 甘藍型油菜BnaA5.AMT1；1和BnaA4.AMT2；1蛋白三級結構預測Fig.5 Prediction of three-dimensional structure of BnaA5.AMT1；1 and BnaA4.AMT2；1 proteins

圖6 甘藍型油菜AMT家族基因在不同組織中的表達情況Fig.6 The expression of BnaAMT family genes in different tissues

S.地上部；R.根；差異顯著性分析采用單因素方差分析，Tukey檢驗，圖中不同字母表示處理之間差異顯著(P<0.05)。圖8同。S.Shoot；R.Root；The significance of difference was evaluated using one-way ANOVA，Tukey test，different letters in the same group indicate significant differences among treatments(P<0.05).The same as Fig.8.

2.6.3 BnaAMT對其他非生物脅迫的響應 隨后，進一步分析了甘藍型油菜AMT家族基因對其他營養脅迫與重金屬脅迫，以及鹽脅迫的轉錄響應情況，其中包括磷脅迫(缺磷)、硼脅迫(缺硼)、鎘脅迫(鎘毒害)以及鹽脅迫(鹽毒害)。在缺磷條件下，BnaC6.AMT1；1和BnaA9.AMT1；2在油菜地上部和根系中的表達量均顯著上升，地上部BnaA7.AMT1；3、BnaA5.AMT2；1和BnaC4.AMT2；1c表達量顯著上升，只有BnaC7.AMT1；4表達量顯著下降，其他基因的表達量無顯著變化(圖8-A)。在缺硼條件下，根系中的BnaAMT1s 3個成員的表達水平均顯著上升；地上部BnaC6.AMT1；1、BnaA9.AMT1；2的表達量顯著上升，只有BnaC7.AMT1；4表達量顯著下降(圖8-B)。無論根部還是地上部，鎘毒對AMT家族基因的表達影響較小(圖8-C)。油菜受到鹽脅迫時，地上部BnaA9.AMT1；2和BnaC4.AMT2；1c表達量顯著上升，BnaC4.AMT2；1和BnaCnn.AMT2；1表達量顯著下降，其他基因表達無顯著變化；根部AMT家族基因整體上則呈現顯著下降的趨勢(圖8-D)。總之，甘藍型油菜在遭受缺硼或者缺磷脅迫時，AMT家族部分基因呈現上升表達趨勢；在鹽脅迫條件下，根系AMT家族基因整體表達量下降；鎘毒對AMT家族基因的表達無明顯影響。

圖8 磷、硼、鎘、鹽脅迫下甘藍型油菜BnaAMT家族基因的轉錄組分析Fig.8 Transcriptome responses of BnaAMT family genes to phosphorus，boron，cadmium and salt stresses

3 結論與討論

本研究通過數據庫比對，在甘藍型油菜全基因組中發現了20個銨轉運蛋白，可分為2個亞家族。其中14個為AMT1家族成員，其余6個為AMT2亞家族成員。由保守基序預測結果可知，甘藍型油菜銨轉運蛋白亞家族內的蛋白質序列保守性強，但亞家族間的差異較大。油菜在進化過程中，基因組發生了多次多倍化事件進而導致油菜內部普遍存在多拷貝基因家族[26-27]，類似作物包括小麥(TriticumaestivumL.)[46]和棉花 (GossypiumhirsutumL.)[47]。因此，擬南芥中的每個基因在油菜中應有6個拷貝[48]。一個基因的多個拷貝的存在釋放了任何單個拷貝以及自然和人為的選擇壓力，這促進了新基因功能的出現[49]。由此產生的變異的增加可以用于培育具有理想表型的作物品種[50]。因此，異源四倍體油菜AMT家族成員是否具有不同于擬南芥的新基因功能還有待進一步研究。

綜上，本研究在甘藍型油菜基因組中共發現了20個銨轉運蛋白，其中14個為AMT1亞家族成員，6個為AMT2亞家族成員。由保守基序預測結果可知，銨轉運蛋白亞家族內的蛋白質序列保守性強，但亞家族之間的差異較大。甘藍型油菜AMT基因與模式植物擬南芥AMT的同源基因的表達模式既有相似之處，又存在差異。這表明在基因組多倍化過程中，AMT基因發生了功能分化，產生了適應油菜的新的基因功能。根部BnaA5.AMT1；1和BnaA7.AMT1；3，葉片BnaC7.AMT1；4和BnaA5.AMT2；1，角果殼BnaA5.AMT2；1表達量高，同時對不同氮水平響應顯著，可以利用這些基因進行遺傳操作以培育具有理想表型的油菜品種。在缺硼或者缺磷脅迫時，BnaAMT家族部分基因呈現上升表達的趨勢；在鹽毒害脅迫下，根系AMT家族基因整體表達量下降；鎘毒對AMT家族基因的表達無明顯影響。這些結果為進一步深入解析甘藍型油菜AMT家族基因的分子功能奠定了基礎。