紅麻HcMS1基因的克隆、表達與功能分析

陳文濤，潘 根，唐慧娟，常 麗，李德芳，趙立寧，陳安國，李建軍

(中國農業科學院 麻類研究所，湖南 長沙 410205)

紅麻(HibiscuscannabinusL.)是錦葵科木槿屬一年生纖維作物，具有抗旱、耐鹽堿、適應性廣、生物量大等特性，在造紙、紡織、建筑材料、復合材料、水土保持、吸附劑、飼料、栽培基質等方面有良好的應用價值[1]，還可有效地緩解土壤重金屬污染問題[2]。紅麻有明顯的雜種優勢，雜交紅麻的韌皮纖維或生物產量可提高40%左右[3]。雄性不育是利用雜種優勢的一條有效途徑，利用細胞質雄性不育(Cytoplasmic male sterility)構建三系配套進行雜交制種可以免去人工去雄，同時提高雜交種子的純度[4]。

目前，國內關于紅麻雄性不育分子機理的研究工作已陸續開展。趙艷紅[5]構建紅麻線粒體atp9基因過表達載體轉化煙草，發現在陽性植株出現葉形、株高、花冠性狀異常且花藥不正常的現象，另外對線粒體基因atp9、atp6和atpA的RNA編輯研究發現轉變的氨基酸大多以非極性氨基酸取代極性氨基酸。史奇奇[6]以紅麻不育系UG93A和保持系UG93B花藥為樣品，分別建立small RNA文庫，并使用高通量測序技術鑒定42個保守miRNA和41個新的miRNA。韋范[7]通過乙酰化蛋白質組學分析在UG93A和UG93B花藥中鑒定到56個乙酰化修飾差異蛋白，并發現乙酰化正向調控GAPDH酶活力以及組蛋白乙酰化調控了細胞質雄性不育的發生。李增強等[8]通過研究紅麻不育系UG93A和保持系UG93B葉片和不同時期花藥基因組DNA甲基化情況，發現甲基化變化的基因在不育系和保持系之間的表達差異顯著，推測這些甲基化變化在雄性不育中發揮了重要的作用。錢景華、陳勵虹等[9-10]分別克隆紅麻轉錄因子MYB21基因和編碼生長素受體的TIR1基因，分析基因表達模式并構建了過表達載體和沉默載體。Chen等[11]通過對紅麻不育系、保持系的轉錄組測序檢測到838個顯著上調基因和528個顯著下調基因，并將其注釋到155個GO和74條KEGG代謝通路上。隨著對紅麻不育機理的研究增多，更多的不育基因得到挖掘，復雜的作用機制和調控網絡逐漸清晰，將在紅麻生產實踐發揮重要的作用。

絨氈層參與花粉壁物質合成，為小孢子發育提供營養并適時地分泌胼胝質酶以釋放小孢子，其在花藥發育中發揮著重要的作用[12]。DYT1-TDF1-AMS-MS188-MS1遺傳途徑被證實調控擬南芥絨氈層發育，其中DYT1、TDF1和AMS在絨氈層早期發育中起作用，而MS188和MS1在絨氈層晚期發育中起重要作用[13-14]。MS1是MS188的直接靶點，在調控擬南芥孢子體花粉外殼蛋白基因的表達起關鍵作用[15]。MS1在擬南芥中編碼PHD-finger蛋白，在四分體期的絨氈層中表達，其突變體不能產生有活力的花粉，花粉在四分體釋放小孢子后不久退化，絨氈層也出現異常空泡化[16]。本試驗在前期紅麻不育系LC0301A和保持系LC0301B的花藥轉錄本中，發現一個顯著差異表達的基因，其編碼蛋白序列與澳洲棉MS1蛋白有90%一致性、與擬南芥MS1蛋白有50%一致性，命名其為HcMS1基因。通過同源克隆的方法獲得了紅麻HcMS1基因，利用生物信息學預測該基因編碼蛋白的結構、保守域和親緣進化關系等，通過qRT-PCR對紅麻不育系、保持系不同時期的花藥進行表達量分析，并構建過表達載體對本氏煙草進行遺傳轉化試驗，以驗證HcMS1基因可能在紅麻不育中發揮一定的作用。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

1.1.1 植物材料 試驗所用紅麻品種不育系LC0301A和保持系LC0301B由中國農業科學院麻類所一年生創新育種團隊提供，種植于麻類所長沙創新試驗基地。根據李建軍等[17]劃分紅麻花粉發育時期的標準，按照花蕾的大小分為4個時期：造孢細胞和小孢子母細胞至減數分裂時期為花蕾一期，四分體到單核期為花蕾二期，雙核期為花蕾三期，花粉成熟期為花蕾四期；取各時期花藥于-80 ℃冰箱保存。

1.1.2 試劑、載體與菌株 TRIzol液，DNAaseI，反轉錄試劑盒，TaKaRa Ex Taq?DNA Polymerase，DNA回收試劑盒，pBLUE-T載體、Pcambia2301-ky過表達載體，T4DNA連接酶，各種相關限制性內切酶購于武漢金開瑞生物工程有限公司。 SteadyPure 植物RNA提取試劑盒，Evo M-MLV反轉錄試劑，SYBR Green qPCR試劑盒購于湖南艾科瑞生物工程有限公司。大腸桿菌感受態細胞DH5α，農桿菌菌株GV3101購于長沙天楚生物科技有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 總RNA提取及cDNA合成 以不育系LC0301A和保持系LC0301B的花藥為材料，采用TRIzol法提取紅麻總RNA，利用瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA完整性；采用TOYOBO公司的逆轉錄試劑盒(ReverTra Ace qPCR RT Kit)進行反轉錄合成cDNA以用于基因克隆。使用SteadyPure植物RNA提取試劑盒提取4個時期的不育系、保持系紅麻花藥RNA，使用Evo M-MLV反轉錄試劑合成cDNA用于qRT-PCR。

1.2.2 紅麻HcMS1基因的PCR擴增及克隆 根據RNA-seq數據，分析鑒定紅麻HcMS1基因轉錄本，利用NCBI(https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/ orffinder /)的Open Reading Frame Finder找出紅麻HcMS1的開放閱讀框。用此序列在Primer 6.0軟件中設計特異性克隆引物(表1)，以紅麻花蕾cDNA為模板，使用Taq酶擴增HcMS1基因的CDS序列，擴增程序：94 ℃預變性3 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min，30個循環；72 ℃延伸5 min。PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳后回收目的條帶連接到pBLUE-T載體，轉化到大腸桿菌感受態DH5α中，37 ℃，100 mg/L氨芐青霉素LB培養基上抗性篩選，挑取陽性克隆進行測序驗證。

表1 引物序列Tab.1 Primers sequence

1.2.3 生物信息學分析 Prot Param(https：//web.expasy.org/protparam/)分析蛋白質理化性質；ProtScale(https：//web.expasy.org/protscale/)預測蛋白質的親疏水性；TMHMM Server v.2.0(http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)分析蛋白質的跨膜結構域；SignalP-5.0 Server(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)分析蛋白質是否含有信號肽；ProtComp 9.0進行亞細胞定位進行分析；Inter-Pro(http：//www.ebi.ac.uk/interpro/)分析蛋白質結構域；SOPMA 分析和預測蛋白質的二級結構；Phyre2分析預測蛋白質的三級結構；MEGA 7.0 軟件構建分子進化樹。

1.2.4 實時熒光定量PCR 根據HcMS1序列設計熒光定量引物(表1)，以紅麻GAPDH基因為內參基因(表1)，以不同樣品反轉錄cDNA為模板。反應體系為20 μL，包含1 μL 模板，10 μL 2×SYBR Premix、10 μmol/L上游引物和下游引物各0.4 μL、滅菌水補足20 μL。定量在BioRad CFX96 qPCR儀進行，程序設置為：95 ℃預變性2 min；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，40個循環后進行熔解曲線分析，以確定引物的特異性。基因相對表達量采用公式2-ΔΔCt計算，使用SPSS 21進行單因素方差分析，利用Origin 9進行繪圖。

1.2.5HcMS1基因過表達載體構建和遺傳轉化 根據HcMS1基因的ORF序列信息，選用SacⅠ/BamH Ⅰ內切酶為酶切位點并設計擴增引物，引物序列為MS1-F2/R2(表1)，以TA克隆為模板進行HcMS1基因的PCR擴增克隆。SacⅠ/BamH Ⅰ雙酶切pcambia2301-ky載體和HcMS1目的基因，回收HcMS1片段和pcambia2301-ky載體，進行連接反應。反應產物轉化大腸桿菌并在50 mg/L卡那霉素(Kana)和50 mg/L利福平(Rif)抗性平板上進行篩選，挑取單克隆菌落過夜搖菌并進行菌落PCR驗證，將PCR陽性菌落提取質粒后進行測序，測序引物為35S-F /2301-F(表1)。將測序后比對成功的過表達載體質粒，采用凍融法轉入GV3101農桿菌并在50 mg/L卡那霉素和50 mg/L利福平抗性平板上28 ℃進行篩選，挑取單克隆菌落180 r/min過夜搖菌15 h，加入等量60%甘油于-80 ℃超低溫保存待用。

本氏煙草轉化試驗參考王會強[18]葉盤法轉化煙草的方法。切取無菌培養的煙草葉片預培養2 d；農桿菌侵染液濃度(OD600)為0.5，侵染時間為5～8 min；煙草葉片與農桿菌共培養最佳時間為2 d。各時期培養基配方為：預培養、共培養培養基(MS+1 mg/L 6-BA + 0.1 mg/L NAA)，分生培養基(MS+1 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA+50 mg/L Kana+500 mg/L Cef)，生根培養基(MS+0.25 mg/L NAA+50 mg/L Kana+500 mg/L Cef)。

2 結果與分析

2.1 HcMS1基因的克隆

TRIzol法提取RNA后取500 ng進行逆轉錄得到cDNA用于后續試驗。以上述cDNA為模板擴增目的基因HcMS1，擴增產物瓊脂糖凝膠電泳檢測結果(圖1-A)，擴增產物與目的片段大小一致且無雜帶。將擴增PCR產物切膠回收后克隆到T載體上，藍白斑篩選后進行菌落PCR擴增，擴增產物瓊脂糖凝膠電泳檢測結果(圖1-B)顯示，在2 000 bp處有明顯的目的條帶，且無特異性擴增。分別取2個菌落PCR檢測為陽性的轉化子進行測序驗證，將測序結果與原始參考序列進行比對，HcMS1基因比對結果(圖2)顯示，測序結果和參考序列比對結果一致，克隆成功。

2.2 HcMS1基因的生物信息學分析

利用Prot Param網站，對紅麻HcMS1基因編碼蛋白的理化性質進行分析。結果顯示：HcMS1基因序列開放閱讀框(ORF)為1 950 bp，共編碼氨基酸數649，包含20種常見氨基酸(表2)，原子總數10 279，分子量73.566 72 ku，分子式為C3270H5118N910O938S43，由于含有43個硫原子，故蛋白中可能存在二硫鍵。帶負電荷的殘基總數(Asp+Glu)為76，帶正電荷的殘基總數(Arg+Lys)為79，理論pI為7.89。HcMS1蛋白的不穩定性指數為30.80，屬于穩定蛋白質；脂肪指數為86.30，親水性指數平均值(GRAVY)為-0.221，更偏向為親水蛋白。

表2 HcMS1編碼氨基酸組成Tab.2 The amino acid composition encoded by HcMS1

2.2.1 親疏水性分析、跨膜結構域及高級結構分析 通過ProtScale在線分析蛋白親疏水性(圖3-A)，在第16位氨基酸出現最低值-3.411，親水性最強，在第80位氨基酸出現最高值2.444，疏水性最強。整體看疏水氨基酸和親水氨基酸分布較均勻，偏向為親水蛋白。利用TMHMM在線分析HcMS1蛋白跨膜結構域(圖3-B)，HcMS1蛋白沒有跨膜結構域，推測為膜外蛋白。

利用SOPMA預測HcMS1蛋白二級結構(圖4-A)，HcMS1蛋白由α-螺旋、延伸鏈、β轉角和無規則卷曲組成，分別占整個肽鏈的37.90%，15.87%，3.85%，42.37%。利用Phyre2模擬HcMS1蛋白三級結構。建模過程中共搜索1 000條序列與目的蛋白序列進行比對，報告單按照置信度大小列出前120條序列模型，并以99.0%置信度，10%序列長度覆蓋度的d1weea(FYVE/PHD zinc finger)蛋白為參考建立模型(圖4-B)。

2.2.2 信號肽、結構域、亞細胞定位分析 通過SignalP-5.0 Server分析(圖5-A)，N端前70位氨基酸殘基，存在信號肽的概率幾乎為零，故推測HcMS1蛋白沒有信號肽，屬于非分泌蛋白。利用Inter-Pro在線分析(圖5-B)，HcMS1蛋白預測到多個結構域(591-641位Znf-PHD-finger、594-640位PHD、593-639位Znf-PHD)，同源性超家族(590-644位Znf-FYVE-PHD、576-643位Znf-RING/FYVE/PHD)和保守序列(594-638位Zinc-finger-PHD-type-CS)。ProtComp 9.0分析HcMS1蛋白亞細胞定位于細胞核。

第一行是TA隆測序序列；第二行是參考序列。First line is reference sequence；The second is sequencing sequence.

圖3 親疏水性分析、跨膜結構域分析Fig.3 Hydrophobicity analysis，transmembrane domain analysis

圖4 二級結構及三級結構預測Fig.4 Prediction of secondary，tertiary structure

圖5 信號肽、結構域分析Fig.5 Signal peptide and domain analysis

2.2.3 進化樹分析 在NCBI的BlastP中輸入HcMS1蛋白序列，在non-redundant protein sequences庫中搜索，獲得多個物種的同源蛋白并下載靠前的20個物種MS1蛋白序列，其中包括：陸地棉(Gossypiumhirsutum)、榴蓮(Duriozibethinus)、木槿(Hibiscussyriacus)、百花鶴望蘭(Herraniaumbratica)、栓皮櫟(Quercussuber)、蓖麻(Ricinuscommunis)、巴西橡膠樹(Heveabrasiliensis)、番木瓜(Caricapapaya)、毛果楊(Populustrichocarpa) 、山茶花(Camelliasinensis)、桑樹(Morellarubra)、木薯(Manihotesculenta) 、大麻(Cannabissativa)、甜櫻桃(Prunusavium)、葡萄(Vitisvinifera)、相思子(Abrusprecatorius)、鷹嘴豆(Cicerarietinum)、月季(Rosachinensis)、蒺藜苜蓿(Medicagotruncatula)、大豆 (Glycinemax)。利用MEGA 7.0軟件，采用鄰近法構建系統進化樹。分析構建結果(圖6)，其中陸地棉MS1蛋白與紅麻HcMS1蛋白進化關系最近，其次為木槿。

2.3 HcMS1表達模式分析

不同時期HcMS1表達模式分析顯示(圖7)，在不育系和保持系的紅麻花藥中，HcMS1的表達隨著花蕾的發育均呈現先升高、后下降的趨勢，其在二期表達量最高，其次是三期，在四期的表達量最低，相對表達量僅為0.1，0.01。比較不育系與保持系發現，保持系二期相對表達量為90.35，是不育系二期表達量的2.5倍，在P值0.05水平下呈現顯著差異。在保持系中，HcMS1于二期表達量超高，而在其他時期均為極低的表達水平，這與擬南芥MS1僅在小孢子釋放期表達事實相吻合；相比保持系，不育系HcMS1表達周期較長，在二期、三期均有相對較高的表達量，且在一期、四期表達水平均高于保持系。

圖6 系統進化樹Fig.6 phylogenetic tree

圖7 HcMS1在不育系、保持系不同時期表達模式Fig.7 Expression pattern of HcMS1 in different stages of male sterile line and maintainer line

2.4 HcMS1基因過表達載體構建和煙草轉化

2.4.1 過表達載體構建 將轉化的大腸桿菌進行PCR擴增，瓊脂糖凝膠電泳結果顯示，在2 000 bp處有明顯目的條帶(圖8)。取PCR陽性菌落提取質粒后進行測序，比對結果顯示目的基因序列與參考序列一致，表示過表達載體構建成功(圖9)。

2.4.2 遺傳轉化 圖中培養基無污染、苗狀態健康(圖10-A)。將生根的煙草組培苗經煉苗后移植到滅菌土中繼續培養，提取野生型煙草和轉化煙草的新鮮葉片DNA，使用測序引物35S-F/2301-F(表1)進行PCR擴增片段，電泳后對比野生型發現轉化煙草在2 000 bp處有目的條帶，證明HcMS1轉化成功(圖10-B)，對煙草成熟期觀察發現：野生型煙草株型較高，可以正常結實，6片花萼大小均勻，花柱較長，果實大且飽滿；而轉基因煙草株型較矮，無法正常結實，6片花萼大小不一，花柱短小，兩者對比有明顯的差異(圖11)。表明通過葉盤法轉化獲得的HcMS1過表達轉基因本氏煙草無法正常自交結實，存在不育現象。

Marker長度為2 000 bp。Marker′s length is 2 000 bp.

3 討論與結論

紅麻不育機理研究目前主要在細胞生物學、分子生物學方面開展工作。在細胞生物學方面，主要通過研究花藥不同發育時期絨氈層和各組織化學成分變化，來確定花S藥敗育時期。大量研究表明，花藥絨氈層發育異常是花粉敗育的重要細胞學原因。朱麗梅等[19]對紅麻細胞質雄性不育系L23A和K03A的小孢子敗育過程進行了細胞學觀察，發現其敗育發生在四分體及單核小孢子時期。一年生麻類作物創新團隊在前期已通過對不育系LC0301A和保持系LC0301B不同時期的花藥細胞學觀察發現，不育系發生敗育的主要時期為單核期，單核期不育系的絨氈層退化嚴重，小孢子出現畸形，不能形成正常的花粉粒[17]。

MS1基因編碼PHD轉錄因子并參與調控花粉和絨氈層發育。目前MS1基因的功能在擬南芥中研究比較詳細，水稻、小麥等其他作物也相繼開展MS1基因的挖掘與分析工作。關于擬南芥的MS1基因的研究，早在21世紀初始便積極展開。Wilson等[16]在2001年報道：擬南芥MS1突變體的花粉在四分體釋放小孢子后不久即發生退化，絨氈層也出現空泡化；MS1在小孢子釋放期的絨氈層部位低水平表達，缺失基因會導致其編碼蛋白的提前終止和PHD-finger基序的丟失。Ito等[20]通過轉座子敲除擬南芥MS1基因，小孢子在四分體中分離出來即發生外層缺失；MS1基因僅在四分體的很短時期內于絨氈層表達，并將MS1定位在細胞核上。2007年，Ito等[21]通過構建MS1-SRDX融合結構轉化擬南芥揭示了MS1具有轉錄激活因子的功能，參與花粉外壁、花粉胞質和絨氈層的發育。2006年，Vizcay-Barrena等[22]通過TUNEL染色和超微結構分析，野生型絨氈層在小孢子有絲分裂Ⅰ后發生程序性細胞死亡(PCD)，而MS1突變體的絨氈層中未觀察到PCD的跡象。隨著人們認識到MS1基因對調控擬南芥雄性不育的重要性，該基因的挖掘開發也在別的作物上相繼展開。2011年，Li等[23]在水稻中的報道了一個擬南芥MS1同源基因PTC1，該基因編碼PHD-finger蛋白，控制絨氈層程序化發育和功能性花粉的形成，其突變體的絨氈層發生增殖失控和壞死樣死亡。2017年，Wang等[24]在小麥中克隆并鑒定MS1基因，其在小孢子母細胞中特異性表達，編碼的蛋白定位于質體和線粒體膜，具有磷脂酶結合活性；Tucker等[25]發現小麥ms1可完全恢復了ms1d突變體的育性，編碼一種花粉外壁發育所必需的糖基磷脂酰肌醇錨定的脂質轉移蛋白。本試驗從紅麻不育系和保持系的花藥中克隆出一個與擬南芥MS1基因相似度較大的同源基因HcMS1，前期通過細胞生物學的手段發現導致不育系花粉敗育的原因在于絨氈層PCD異常，絨氈層退化嚴重且提前，這與擬南芥中報道的MS1調控絨氈層PCD發育相似；同時通過qRT-PCR發現HcMS1花蕾二期的表達量在保持系中顯著高于不育系，且在保持系中該基因幾乎只在花蕾二期高度表達，這又與擬南芥MS1表達模式相符合，另外相比保持系，不育系在較長時間都保持著較高水平的表達，推測HcMS1表達時期的紊亂也可能是導致紅麻不育的原因之一。綜合以上，推測HcMS1基因在調控紅麻雄性不育的過程中亦發揮著一定的作用。

第1行是參考序列；第2行是測序序列。First line is reference sequence；The second is sequencing sequence.

Marker長度為2 000 bp；+. 質粒陽性對照；-. 無DNA陰性對照；WT. 野生型；HcMS1.轉基因煙草。Marker length is 2 000 bp； + . Plasmid positive control；-. Non-DNA negative control；WT. Wild type； HcMS1.Transgenic tobacco.

MS1. PCR鑒定陽性煙草；WT. 野生型煙草。MS1. PCR positive tobacco; WT. Wild type.

唐文武等[26]以擬南芥花粉發育關鍵基因MS1為參考序列，通過Blast比對獲得蕓薹屬作物同源基因序列，運用生物信息學方法對其編碼氨基酸序列進行預測分析，為作物雜種優勢利用提供理論參考。高嵩等[27]同源克隆玉米ZmUdtl基因并利用生物信息學分析預測蛋白性質、結構等，為后期的克隆和功能鑒定奠定基礎。為了預測HcMS1基因的結構功能，挖掘基因潛在信息，本試驗通過生物信息學方法對HcMS1蛋白進行預測分析。結果顯示，該蛋白為親水蛋白，沒有信號肽和跨膜結構，存在典型的PHD-finger結構域，該結構域廣泛存在于雄性不育基因MS1編碼蛋白中；其亞細胞定位在細胞核上，推斷HcMS1蛋白可能作為轉錄因子，作用于細胞核上，調控與育性相關的基因表達。進化樹分析結果顯示，紅麻HcMS1蛋白與陸地棉MS1蛋白親緣關系最近。

煙草作為一種模式植物，其轉基因體系已相當成熟，目前有很多在煙草上進行異源表達的研究，且大都獲得了與研究目的有關聯的價值性狀[28-29]。試驗通過本氏煙草遺傳轉化發現，35S強啟動子過表達HcMS1基因在陽性轉基因煙草中表現為植株矮化、花萼變小且大小不均、花柱縮短、無法結實，說明過表達HcMS1基因有影響本氏煙草正常育性的功能，為驗證HcMS1是調控紅麻雄性不育的關鍵基因提供了有力的支撐。

總之，本研究利用同源克隆方法在紅麻花藥中克隆出HcMS1基因，通過生物信息學分析發現HcMS1蛋白有顯著的PHD結構保守域，其亞細胞定位于細胞核上，很有可能以轉錄因子的形式調控育性基因的表達。此外，qRT-PCR結果顯示，HcMS1基因在紅麻保持系花蕾的四分體至單核期高量表達，符合擬南芥MS1基因表達模式。最后，通過本氏煙草遺傳轉化試驗，在獲得的HcMS1過表達本氏煙草上發現了顯著的不結實現象。本研究克隆出紅麻HcMS1基因，并結合生物信息學、基因表達和煙草轉化對其進行分析，為挖掘紅麻不育調控基因提供了一定信息資源，為日后該基因的深度功能解析做好了鋪墊。