甘藍型油菜抗根腫病KASP標記開發和利用

鐘婷婷，郭詩芬，盧文斌，肖 鋼，2

(1.湖南農業大學 農學院，湖南 長沙 410128；2.水稻油菜抗病育種湖南省重點實驗室，湖南 長沙 410128)

根腫菌屬原生動物界(Protozoa)，根腫菌綱(Plasmodiophoromycetes)，根腫菌目(Plasmodiophorales)，根腫菌屬(Plasmodiophora)，對油菜、甘藍等多種十字花科作物危害嚴重，調查表明田間受根腫病危害的油菜發病較輕減產30%左右，嚴重田塊可造成油菜絕收[1]。根腫菌休眠孢子的抗逆性強，可在土壤中存活數十年之久，主要為害十字花科植物根部，其根表皮薄壁細胞受到根腫菌刺激后大量分裂和膨大，呈大小不一形狀不規則的腫瘤[2]；從微觀層面上講，寄主植物的一些正常生理代謝受到影響[3]，誘導植物產生吲哚乙酸(Indole-3-acetic acid)、細胞分裂素(Cytokinin)、糖類(Carbohydrate)以及蛋白質(Protein)，隨即產生腫根。研究學者們對蕪菁、甘藍、蘿卜等資源進行篩選鑒定后獲得部分抗病信息：蕪菁(Brassica.rapa，AA，2n=20)根腫病抗性是由單顯性基因控制的數量性狀遺傳[4]，具有小種特異性。甘藍(Brassicaoleracea，CC，2n=18)根腫病抗性是由多基因控制的數量遺傳性狀，且多為隱性遺傳，抗感范圍廣、遺傳規律較為復雜，由于不同定位研究使用不同的根腫病抗性源及不同的蕓薹根腫菌分離株，導致定位起來比較困難。蘿卜(Raphanussativus)根腫病抗性普遍較強，大部分蘿卜品種對根腫病抗病性可能是由單個顯性位點控制，受顯性主效基因控制，同時還可能存在其他微效抗性基因[5]。胡靖鋒等[6]通過抗根腫病蘿卜胞質不育系和甘藍自交系雜交，獲得抗根腫病AACC型染色體甘藍型油菜材料ZZCZ13000。部分抗病基因已在育種中廣泛應用：華中農大選育出首批具有應用價值的抗根腫病甘藍型油菜(B.napusL.AACC，2n=38)雜交新品種華油雜62R(含抗4號生理小種抗病位點CRb)和常規新品種華雙5R(含抗4號生理小種抗病位點PbBa8.1)，對根腫病4號生理小種具有免疫抗性，為我國育種家提供了新材料。

隨著后基因組時代的到來，第三代分子標記SNP應運而生。由LGC(Laboratory of the Government Chemist 英國政府化學家實驗室)開發的競爭性等位基因特異性PCR(Kompetitive Allele Specific PCR,KASP)基因分型技術，可以對SNP和特定位點上的InDel進行精準的雙等位基因判斷，基于自己獨特的ARMSPCR原理實現SNP分型，SNP在基因組中具有分布密度高、突變率低、二態性高、穩定性好、易于進行高通量自動化分析等特點[7]，在水稻、小麥等作物性狀基因的精細定位、分子輔助育種、種子資源鑒定等方面發揮重要作用。Han等[8]利用雄性不育突變體位點Ms-cd1開發的KASP標記，成為甘藍Ms-cd1開發的首批KASP標記。張強等[9]利用KASP標記鑒定辣椒細胞質類型，為辣椒三系雜交育種的應用奠定了研究基礎。Yang等[10]基于KASP標記技術將種質群體劃分為秈型和粳型2個亞群體，有效地維護和利用水稻遺傳資源。Fang等[11]利用六倍體小麥抗葉銹病基因Lr34第11外顯子和第22外顯子等位變異SNP位點開發的KASP標記，能加速小麥Lr34的篩選。Devran等[12]針對抗番茄斑萎病原菌Sw-5基因座開發了KASP標記，并在多個具有不同遺傳背景的番茄基因型中進行驗證，能成功篩選番茄斑萎病純合子抗性植株、雜合子抗性植株和感病品種植株。

Crr1基因來源于歐洲飼料蘿卜Siloga，目前已經從Siloga中鑒定出Crr1、Crr2和Crr43個抗病基因，分別位于A08、A01和A06染色體上，對根腫病4號生理小種具有抗性。對Crr1基因精細定位發現：Crr1可能包含2個基因位點，一個主要的根腫病抗性基因位點Crr1a和另一個作用較小的次要基因位點Crr1b[13]，其中Crr1a編碼TIR-NB-LRR抗病蛋白。Hatakeyama等[14]和Suwabe等[15]研究發現Crr2基因是Crr1和Crr4基因表達的增強劑，也就是說，只有與Crr2基因相互作用時，Crr1和Crr4才能對4號生理小種產生抗性。我國對根腫病的研究起步較晚，基于根腫病基因的KASP標記研究還不多，本試驗中抗性親本華雙5R含有從蕪菁轉育來的抗病位點PbBa8.1，該位點包含一個抗病基因Crr1[16]。甘藍型油菜(B.napusL.AACC，2n=38)基因組中LOC103834349基因與蕪菁Crr1基因有較高的同源性，本研究對抗病親本華雙5R的Crr1基因與感病親本LOC103834349基因進行克隆測序，發現部分SNP位點，針對第1486-1487上的非同義突變位點，開發了一套精準檢測自交后代抗根腫病基因型的KASP分子標記，能夠快速精準檢測抗感甘藍型油菜的基因型，大幅提高了甘藍型油菜根腫病抗性育種效率。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

抗性親本材料甘藍型油菜華雙5R(含根腫病4號生理小種抗病位點PbBa8.1，來自華中農業大學作物遺傳育種研究所油菜研究室)為供體親本。25個農藝性狀好，含油量在48%～54%，油酸含量在70%～78%的甘藍型油菜自交系(來自水稻油菜抗病育種湖南省重點實驗室)為受體親本進行雜交獲得F1，F1后代經過自交獲得F2群體。2020年10月13日將42個F2群體播種在上一年根腫病發病嚴重的田塊中。

1.2 試驗方法

1.2.1 田間表型鑒定 材料種植地上一年根腫病發病嚴重，發病率95%左右。播種前利用根腫菌18S rRNA特異引物對田間土壤病菌孢子含量進行熒光定量PCR測定，孢子數為5.1×103～104個/g。田間鑒定在2020年12月12日進行，將每個單株小心從土壤中拔出，仔細檢查根部發病情況，根據發病與否進行登記掛牌。挑選經過田間抗病鑒定的42個F2群體的771個單株進行KASP分型檢測。

1.2.2 DNA的提取 取0.1～0.5 g大小的葉片放入96孔板，置于凍干機中抽真空16 h后于研磨儀中研碎。在96孔板中每孔加入500 μL DNA提取液，振蕩混勻后于75 ℃烘箱中溫浴30 min。溫浴結束后，4 000 r/min離心10 min，取96孔板中190 μL上清液至新的96孔板，并在新的96孔板中每孔加入190 μL異丙醇。將96孔板于-20 ℃冰箱中放置1 h，然后4 000 r/min離心10 min，棄上清液，置于50 ℃烘箱中烘干，加入500 μL超純水溶解DNA，4 ℃保存用于后續的KASP檢測。

1.2.3 KASP分子標記設計 在數據庫中查找Crr1和LOC103834349序列間的SNP位點(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/)，選擇位于編碼區內第1 486-1 487上非同義突變位點，應用引物設計軟件Batch Primer3設計KASP標記引物，包括3條引物：K07-X、K07-Y是2條等位基因特異性正向引物，5′端分別加上熒光序列標簽VIC和FAM(下劃線部分為熒光序列標簽)，3′末端堿基為SNP位點變異堿基，2條特異性引物末端堿基分別包括SNP位點的等位變異；K07-C為共同的反向引物(圖1)。KASP-PCR反應LGC SNP line基因分型平臺上進行，反應總體系為0.8 μL，100 μmol/L Primer由濃度為100 μmol/L的K07-X、K07-Y、K07-C與超純水按12∶12∶30∶46的體積比混合得到。PCR反應混合物(0.8 μL)包含：100 μmol/L Primer 0.005 9 μL、2×KASP Master Mix 0.394 5 μL、超純水0.399 5μL、DNA(干燥)20～50 ng。PCR程序為：94 ℃預變性15 min；95 ℃變性20 s，56～65 ℃退火延伸60 s，每循環退火延伸溫度降低0.8 ℃，共計10個循環；94 ℃變性20 s，57 ℃退火延伸60 s，共30個循環。

KASP-PCR擴增產物反應完成后利用掃描儀Pherastar對KASP反應產物進行熒光數據讀取，熒光掃描的結果自動轉化成圖形。

1.2.4 測序驗證 根據LOC103834349和Crr1基因序列設計引物LOC-1(表1)，該引物對可以擴增

KASP標記SNP位點上下游281 bp的基因序列。取田間鑒定抗病和感病的油菜各6株，提取DNA后用上面引物進行PCR擴增。PCR反應體系25 μL，包括1.1×T3 PCR Mix 22 μL(北京擎科生物科技有限公司)、10 μmol/L上下游引物各1 μL、478 ng/μL基因組DNA 1 μL。擴增程序為98 ℃預變性2 min；98 ℃變性10 s，退火溫度60 ℃退火10 s，72 ℃延伸10 s，34個循環；最后72 ℃延伸2 min，于4 ℃保存。PCR產物由北京擎科生物科技有限公司進行測序，測序結果使用軟件DNAMAN進行序列比對。

2 結果與分析

2.1 田間鑒定

對種植于大田的F2植株逐一拔出用目測法檢查根系生長情況，確定其抗感表型。從42個F2群體中共鑒定了771個單株，其中有456株根系正常，沒有染病。有315株根部有腫塊，為染病植株(圖2)。

左側為抗性材料；右側為感病材料。The left is the clubroot resistant plants；The right is the clubroot susceptible plants.

2.2 KASP標記開發與驗證

利用該等位變異SNP位點設計的KASP標記對經過田間鑒定的771個單株進行分型檢測。檢測結果顯示，待檢測材料清楚地分為兩類(圖3)：聚合在接近X軸的顯示藍色的樣本的基因型為連接VIC熒光標簽序列的純合抗病AA基因型，聚合在接近Y軸上的顯示紅色的樣本的基因型為連接FAM熒光標簽序列的純合感病GG基因型，位于坐標軸接近45度軸心顯示紫色的樣本基因型表示含有A和G的雜合基因型，左下角顯示黑色的樣本為空白對照。其中315個單株含有純合感病基因型GG，322個單株含有純合抗病基因型AA，134個單株含有基因型GA。對編號為2033的F2群體中125株材料的KASP分型情況(表2)進行χ2檢測，其中純合抗病基因型AA 30株，純合感病基因型GG 33株，雜合基因型GA 62株，經χ2檢測，抗病材料與感病材料符合3∶1理論值，抗病純合基因型、抗病雜合基因型與感病純合基因型的比值符合1∶2∶1理論值，說明該抗病位點為顯性單基因抗病位點。

圖3 KASP標記對771份油菜單株分型Fig.3 KASP marking classification map of 771 Brassica napus

表2 編號2033 F2群體KASP分型與田間鑒定結果Tab.2 KASP typing and field identification results of the No.2033 F2 population

表2(續)

AA分型和雜合的GA分型單株田間檢測均為抗病表型，GG分型均為感病表型，KASP分型結果與田間鑒定結果一致。比對結果說明，該KASP標記對根腫病抗、感植株進行正確分型，可作為新型分子標記應用于根腫病的分子標記輔助選擇。

2.3 測序驗證

取抗、感親本材料各6株，提取DNA后擴增KASP標記位點上下游281 bp堿基序列。PCR產物進行測序驗證，結果顯示，抗病親本在KASP引物設計位點為AA堿基，感病親本則為GG堿基(圖4)，測序結果證明了KASP分型結果準確性。

1～6.感病親本；7～12.抗病親本。1-6.Susceptible parents；7-12.Resistant parents.

3 討論與結論

分子標記可以避免環境條件對雜種優勢類群分類的影響，對于一些系譜不清或者混合的材料可以有根據性的劃分為不同類群。針對雜種優勢類群，人們開發了許多標記系統，如RAPD、AFLP、SSR和SNP，以及一些經濟有效的基因分型平臺來檢測SNP位點，如Golden Gate[17]和Infinium[18]平臺，TaqMan和KASP平臺[19]。KASP分析在用于基因分型的SNP數量方面提供了靈活性，該方法準確度高，成本低，這一特征使KASP標記比其他SNP基因分型分析更具優勢。本研究針對與根腫病抗性顯著關聯的SNP位點開發了KASP標記，能有效將雜交后代的基因型分類，在檢測的771個樣本中，315個單株為純合感病基因型GG，322個單株為純合抗病基因型AA，134個單株為雜合抗病基因型GA，與田間檢測結果一致。其中編號2033的F2群體125株材料中純合抗性基因型AA 30株，純合感病基因型GG 33株，雜合基因型GA 62株。經χ2檢測，抗病材料與感病材料符合3∶1比例，抗病純合基因型、抗病雜合基因型與感病純合基因型的比值符合1∶ 2∶1理論值，說明該抗病位點為顯性單基因抗病位點，與預期相符。

前人以白菜(B.rapa，AA，2n=20)為根腫病抗性材料，定位了10個CR基因[15，20-28]，Crr1、Crr2、Crr3、Crr4、CRa、CRb、CRc、CRd、CRk、CRs，以及5個抗病位點，PbBa1.1、PbBa3.1、PbBa3.2、PbBa3.3、PbBa8.1。其中CRa是首個被人工克隆的根腫病基因[29]；在蘿卜(R.sativus)根腫病抗性相關的QTL定位檢測中，檢測出RsCr1、RsCr2、RsCr3、RsCr4和RsCr55個抗性基因[30]。華雙5R對根腫病抗性的產生是由于從蕪菁ECD04中導入了含有PbBa8.1抗性位點的蕪菁基因組片段，該片段含有根腫病抗性基因Crr1。根腫病抗性由2種途徑控制，一種是在抗性中起共同調控作用的途徑，另一種是起增強抗性的額外途徑。這2種途徑揭示了關于根腫病抗性進化的假說，一是根腫病抗性最初是由單一的主效基因控制，在蕓薹屬植物基因組的進化過程中，主效基因分化為2個功能不同的重復基因；另一種是抗性基因最初聚集在某一原始基因組區域，由于外界環境等其他因素的影響導致染色體重新排列后分布在不同的基因組區域，在擬南芥(Arabidopsisthaliana)的某些基因組區域已經觀察到抗病基因的聚類。其中，Crr1和Crr22個主要QTL區域在擬南芥第4號染色體的一個小區域內存在重疊，該區域屬于擬南芥基因組抗病基因簇MRCs之一。這些結果表明，根腫病抗性基因起源于一個共同祖先基因組MRC，隨后在進化過程中分布到不同區域。甘藍型油菜(B.napusL.AACC，2n=38)是由白菜(B.rapa，AA，2n=20)與甘藍(B.oleracea，CC，2n=18)通過自然雜交和染色體組自然加倍后形成，在進化的過程中，蕪菁ECD04保留了根腫病抗性，而甘藍型油菜散失了根腫病抗性，推測可能原因之一是在漫長的進化過程中甘藍型油菜基因組中LOC103834349基因丟失了部分序列，從而使其根腫病抗性散失了。

本研究針對甘藍型油菜LOC103834349基因和根腫病抗病親本Crr1基因開發了一個高通量、低成本的根腫病KASP分子標記。田間表型驗證表明該標記準確可靠，可以在短時間內對大量材料進行快速可靠的分析鑒定，提高油菜根腫病抗性育種效率，該標記可作為一個新的高通量、高選擇效率的分子標記，能快速準確篩選抗根腫病材料。