前列腺癌組織中雄激素受體剪接變異體7的表達及臨床意義

王艷龍，張洪麟，杜浩，任宇，于廣海，劉志宇

（大連醫科大學1.附屬大連市中心醫院泌尿外科，遼寧 大連 116033；2.附屬大連婦產醫院生殖健康中心，遼寧 大連 116033；3.附屬第二醫院泌尿外科，遼寧 大連 116023）

前列腺癌是男性泌尿生殖系統常見的惡性腫瘤之一，晚期前列腺癌患者主要治療方法是雄激素剝奪治療（androgen deprivation therapy，ADT）。ADT治療后多數患者會產生耐藥并發展為轉移性去勢抵抗性前列腺癌（metastatic castration-resistant prostate cancer，mCRPC）［1］。mCRPC是臨床治療的難點和患者死亡的主要原因。雄激素受體剪接變異體（androgen receptor splice variants，AR-Vs）在前列腺癌的治療耐藥和進展中起著重要作用。其中雄激素受體剪接變異體7（androgen receptor splicing variant 7，AR-V7）通過激活雄激素受體信號通路、促進下游旁分泌等多種機制來促進前列腺癌的進展［2］。目前，AR-V7是公認的指導mCRPC患者選擇化療或者新型內分泌治療的標志物［3］，此外，AR-V7對治療結果的預測能力因不同的檢測方法而不同。本研究檢測不同分期前列腺癌中AR-V7的表達，同時與良性前列腺增生組織進行比較，探討AR-V7在前列腺癌臨床進展和骨轉移中的臨床意義。

1 材料與方法

1.1 標本來源及分組

收集2017年3月至2019年3月大連醫科大學附屬大連市中心醫院泌尿外科48例患者組織標本。其中前列腺增生患者（經尿道前列腺電切術后病理確診）18例（良性增生組），無轉移局限性前列腺癌患者（CT/MRI/ECT骨掃描未見遠處轉移，根治術后病理確診）18例（局限癌組），骨轉移前列腺癌患者（CT/MRI/ECT見遠處骨寡轉移或內臟少量轉移，根治術后病理確診）12例（骨轉移癌組）。收集MRI報告前列腺癌病灶的最大徑線值。局限癌組前列腺腫瘤大小為（1.42±0.06）cm，腫瘤分期T1期3例、T2期6例、T3期6例、T4期3例。骨轉移癌組前列腺腫瘤大小為（2.12±0.14）cm，腫瘤分期T2期2例、T3期5例、T4期5例。納入標準：患者未接受任何抗雄或去勢等內分泌治療；未接受放射治療或化療。標本組織離體取出清洗后標記，盡快放入液氮轉運至-80 ℃冰箱保存。本研究經大連市中心醫院倫理委員會審批通過（2017-010-11）。

1.2 方法

1.2.1 免疫組化及陽性結果評定：組織切片經過脫蠟、水化、抗原修復、血清封閉，室溫下孵育一抗AR-V7（英國Abcam公司，1 ∶200）60 min，用已證實ARV7表達陽性的前列腺癌組織切片作陽性對照，加入PBS作陰性對照，然后孵育二抗15 min，經DAB顯色，蘇木素復染、脫水封片后顯微鏡下觀察。高倍鏡下對每張切片隨機取5個視野，根據染色陽性細胞比例和陽性程度進行評分。A，按照陽性細胞占總上皮細胞比例評分：0%，0分；＞0%～25%，1分；＞25%～50%，2分；＞50%～75%，3分；＞75%，4分。B，按照染色的陽性程度評分：不著色、少許淺黃色，0分；淺黃色，1分；棕黃色或棕色，2分；深棕色、棕褐色，3分。A與B分數之和來判斷切片染色的陽性等級：0分，陰性（-）；1～3分，弱陽性（+）；4～5分，陽性（++）；6～7分，強陽性（+++）。

1.2.2 實時熒光定量PCR（real time quantitative PCR，qRT-PCR）檢測AR-V7mRNA表達：將組織樣品加入預冷的 TRIzol（日本TaKaRa公司）中，充分裂解細胞，提取總RNA，應用反轉錄試劑盒逆轉錄cDNA。使用實時定量熒光PCR儀（美國ABI公司），TransStart?Green qPCR Supermix 試劑盒進行檢測。生工生物工程有限公司合成引物，AR-V7上游引物5’-GGAAATGTTATGAAGCAGGG-3’，下游引物5’-GGTCATTTTGAGATGCTTGC-3’。GAPDH上游引物5’-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3’，下游引物5’-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3’。

1.3 統計學分析

采用SPSS 26.0軟件進行統計分析，計量資料采用表示，組間比較采用t檢驗，計數資料用率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗，P＜ 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 3組免疫組化檢測結果

結果顯示，良性增生組1例弱陽性，17例陰性，陽性表達率5.6%；局限癌組2例陽性，1例強陽性，15例陰性，陽性表達率16.7%，骨轉移癌組3例陽性，4例強陽性，5例陰性，陽性表達率58.3%，3組比較差異有統計學意義（χ2=11.99，P=0.002），見表1、圖1。

圖1 3組免疫組化結果比較 ×400Fig.1 Comparison of immunohistochemical results for the three groups ×400

表1 3組免疫組化結果比較［n（%）］Tab.1 Immunohistochemistry results among the three groups［n（%）］

2.2 3組AR-V7 mRNA檢測結果比較

qRT-PCR結果顯示，良性增生組、局限癌組和骨轉移癌組AR-V7mRNA 表達分別為1.03±0.11、6.36±0.15和14.39±0.13。與良性增生組比較，局限癌組AR-V7mRNA 表達顯著增高（P＜ 0.05）；與良性增生組、局限癌組比較，骨轉移癌組AR-V7mRNA 表達顯著增高（P＜ 0.05），說明AR-V7mRNA表達隨腫瘤臨床進展而升高。

3 討論

前列腺癌是激素依賴性腫瘤，雄激素促進前列腺癌的生長和進展，雄激素受體是常用的前列腺癌的治療靶點。然而，靶向藥物最終會導致雄激素受體畸變，促進前列腺癌進展和耐藥，導致mCRPC。研究［4］顯示，10%～30% mCRPC患者循環腫瘤細胞（circulating tumor cells，CTCs）AR-V7陽性表達，這類患者使用新型雄激素受體抑制劑（阿比特龍或恩雜魯胺）效果不佳，但對化療敏感［5］。目前AR-V7的檢測方法多樣，qRT-PCR是目前最常用的方法，但技術路線復雜［6］。AR-V7mRNA的檢測結果因不同檢測標本存在差異［7］，而組織標本檢測具有結果可靠、靈敏度較高、技術簡單等優點，是目前常用的檢測方法。

研究［8］表明AR-V7 也存在于正常細胞（癌旁組織或良性腺體）中，本研究發現前列腺良性增生組中1例AR-V7弱陽性（5.6%），與以往研究結果一致。SCHER等［9］分析顯示，CTCs細胞核中含有AR-V7蛋白的患者，在基于紫杉醇類化療中有更長的生存時間。ERB等［10］采用免疫組化檢測AR-V7對無進展生存期和治療反應的預測價值，認為AR-V7蛋白在CTCs中的表達不能預測mCRPC的治療反應，AR-V7在CTCs中作為生物標志物的價值臨床上仍然需要進一步驗證。

本研究采用組織標本進行AR-V7檢測，結果顯示AR-V7mRNA 表達在骨轉移癌組最高，局限癌組次之，良性增生組最低。與良性增生組比較，局限癌組AR-V7mRNA 表達顯著增高（P＜ 0.05）；與良性增生組、局限癌組比較，骨轉移癌組AR-V7mRNA 表達顯著增高（P＜ 0.05），提示 AR-V7 的表達可能與前列腺癌的臨床進展相關。OUYANG等［11］研究認為前列腺癌組織中AR-V7水平與根治性前列腺切除術后接受輔助激素治療患者的無進展生存期、總生存期和癌癥特殊生存期的不利預后相關，與本研究結果一致。

綜上所述，前列腺癌組織中AR-V7表達增高，且與前列腺癌的臨床進展相關，提示AR-V7可能參與前列腺癌的臨床進展和骨轉移的發生。但是，AR-V7如何促進mCRPC形成以及AR-V7如何參與新型雄激素受體抑制劑耐藥機制尚不清楚，需進一步研究論證。