滌痰湯對血管性癡呆大鼠海馬TNF-α、NF-κB、IL-1β、IL-10表達的影響

楊超 楊佳 劉玲

(1湖北中醫藥大學，湖北 武漢 430061；2湖北省中西醫結合醫院老年病科；3華中科技大學同濟醫學院附屬協和醫院中西醫結合科；4湖北中醫藥大學第一臨床學院)

滌痰湯治療血管性癡呆(VD)療效確切，但其作用機制尚不明確。腦缺血引起的炎癥反應在VD的發生發展過程中扮演了重要角色〔1〕。本實驗通過觀察滌痰湯對VD大鼠海馬組織腫瘤壞死因子(TNF)-α、核因子(NF)-κB、白細胞介素(IL)-1β、IL-10表達的影響探討其治療VD的可能機制。

1 材料與方法

1.1實驗動物 SPF級健康Wistar大鼠40只，鼠齡8～10 w，雄性，體重(200±20)g，購自湖北省疾控中心，許可證編號：SCXK(鄂) 2008-0004。

1.2藥物和試劑 滌痰湯由制半夏8 g，天南星8 g，橘紅5 g，炒枳實6 g，茯苓6 g，人參3 g，竹茹2 g，石菖蒲3 g，甘草1.5 g，生姜5 g組成，購于湖北省中醫院，分別水煎濃縮成含生藥量0.971 g/ml、0.485 g/ml，無菌分裝后備用。一抗兔抗大鼠TNF-α和兔抗大鼠NF-κB抗體(abcam公司，英國)、二抗山羊抗兔抗體(abcam公司，英國)；蘇木素-伊紅(HE)染色所需試劑由國家中醫藥管理局老年性癡呆(醒腦益智)重點研究室提供；IL-1β、IL-10試劑盒購于南京建成生物工程研究所。

1.3儀器 RM2235自動切片機(德國徠卡)，SA201 Morris水迷宮視頻分析系統(江蘇賽昂斯生物科技有限公司)，KZ-Ⅱ型勻漿儀(康濤科技有限公司)，DYY-6C型電泳儀(北京六一儀器廠)，V300型掃描儀(EPSON)，722S型可見分光光度計(上海精密科學儀器有限公司)，TGL-16C型離心機(上海安亭科學儀器廠)。

1.4造模 動物適應性喂養1 w后，采用改良的永久性雙側頸總動脈結扎法制備VD大鼠模型：大鼠術前6 h禁水，12 h禁食，給予10%水合氯醛(3 ml/kg)腹腔注射麻醉，剪去頸前部手術區域毛發，消毒，鈍性分離左側頸總動脈，用0號手術線結扎左側頸總動脈的近心端和遠心端，用剪刀從中間剪斷，依次逐層縫合。縫合后于手術切口局部皮下注射慶大霉素0.2萬U預防感染。1 w后在同樣條件下，結扎并剪斷右側頸總動脈。假手術組分離雙側頸總動脈，但不結扎。

1.5分組與給藥 將40只大鼠隨機分為VD模型組、假手術組、滌痰湯高劑量組、滌痰湯低劑量組，每組10只，造模成功1 w后開始灌胃給藥，給藥量均按人與大鼠體表面積系數比確定。滌痰湯低、高劑量組給藥量為滌痰湯折合生藥量4.85 g/kg、9.71 g/kg，模型組、假手術組給予等量生理鹽水灌胃，每日1次，連續4 w。

1.6檢測方法

1.6.1Morris水迷宮測試 水迷宮實驗的前1～5 d為定位航行測試，第6天為空間搜索實驗。定位航行測試：將各組大鼠按照順時針的順序從水池的四個象限放入水中，記錄120 s內大鼠從入水到找到平臺后四肢爬上平臺并停留超過10 s所需的時間(即逃避潛伏期)，每天4次，連續5 d，取平均值。空間搜索實驗：第6天，將平臺撤除，將大鼠由任意象限放入水中，記錄大鼠在120 s內跨越原平臺的次數及停留時間。

1.6.2海馬組織形態學觀察 Morris水迷宮結束后當天斷頭處死大鼠，冰上迅速取腦組織，留取包含完整海馬的腦段，置于4%多聚甲醛中固定，然后經過脫水、包埋后，制作成4 μm左右厚度的切片，再經過HE染色后觀察海馬組織學改變。

1.6.3免疫組化法檢測核因子(NF)-кB的表達 將上述各組石蠟切片用SP法進行免疫組織化學染色，其方法嚴格按照試劑盒說明進行。組織中棕黃色或棕褐色顆粒為目標蛋白。在光學顯微鏡下，每張片子隨機選取 5 個視野，采用 Leica Qwin 圖像分析系統分析目標蛋白NF-кB的表達情況(表達平均灰度=視野灰度 × 陽性細胞比率)。

1.6.4Western印跡法檢測海馬組織腫瘤壞死因子(TNF)-α蛋白表達 每組稱取100 mg海馬組織，剪碎、勻漿、離心后，收集上清液，后用二喹啉甲酸(BCA)法測定蛋白濃度，再進行十二烷基硫酸鈉(SDS)-聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)，轉膜后，在室溫下將膜置于脫色搖床上用5%的脫脂牛奶，封閉2 h。封閉液稀釋一抗，4℃孵育過夜。次日，TBST洗膜3次，每次10 min。之后加入1∶3 000稀釋二抗，室溫下孵育30 min后，用TBST洗膜3次，每次10 min。電化學發光(ECL)化學顯影、定影及曝光后，Alpha軟件處理系統對目標條帶進行分析。

1.6.5酶聯免疫吸附試驗(ELISA)檢測海馬組織白細胞介素(IL)-1β、IL-10含量 取大鼠海馬組織1 g，按1∶9(大鼠海馬組織∶生理鹽水體積)加入冰生理鹽水，充分研磨制備成海馬組織勻漿。4℃，2 500 r/min離心10 min，吸取上清液，即為海馬組織勻漿。加樣：分別設空白孔、標準孔、待測樣品孔。空白孔加標準品&樣品稀釋液 100 μl，余孔分別加標準品或待測樣品 100 μl，輕輕晃動混勻。棄去液體，甩干。每個孔中加入生物素化抗體工作液 100 μl。酶標板加上覆膜，37℃溫育1 h。棄去孔內液體，甩干，洗板3次，每次浸泡1～2 min。每孔加酶結合物工作液100 μl，加上覆膜，37℃溫育30 min。棄去孔內液體，甩干，洗板5次。每孔加底物溶液(TMB)90 μl，酶標板加上覆膜 37℃避光孵育15 min左右。每孔加終止液50 μl。立即用酶標儀在450 nm波長測量各孔的光密度(OD值)。

1.7統計學分析 采用SPSS22.0軟件進行單因素方差分析。

2 結 果

2.1各組大鼠Morris水迷宮實驗結果比較 大鼠定位航行實驗結果：與假手術組比較，模型組逃避潛伏期明顯延長(P<0.01)；與模型組比較，滌痰湯低劑量組、滌痰湯高劑量組的逃避潛伏期顯著縮短(P<0.05，P<0.01)。空間探索實驗結果：與假手術組比較，模型組停留時間及穿越原平臺次數明顯減少(P<0.01)；與模型組比較，滌痰湯低、高劑量組停留時間及穿越原平臺次數顯著增加(P<0.05，P<0.01)。與滌痰湯低劑量組比較，滌痰湯高劑量組停留時間及穿越原平臺次數顯著增加(P<0.05)。見表1。

表1 各組水迷宮實驗結果比較

2.2海馬組織病理學觀察結果比較 假手術組海馬區神經元染色均勻，形態飽滿，邊界清晰，數量正常，細胞核呈類圓形，細胞膜、核膜清楚。模型組海馬區神經元染色不均勻，細胞形態不規則，細胞邊界模糊，數量減少，可見壞死的神經元，細胞核固縮，細胞膜、核膜不清晰。與模型組對比，滌痰湯低劑量組、高劑量組神經元染色較均勻，細胞形態較規則，細胞邊界較清晰，數量增多。見圖1。

圖1 各組大鼠海馬組織病理學形態(HE，×400)

2.3NF-кB的表達結果比較 與假手術組相比，模型組NF-кB表達量明顯增高(P<0.01)；與模型組比較，滌痰湯低劑量組、滌痰湯高劑量組NF-кB表達量顯著下降(P<0.05，P<0.01)；與滌痰湯低劑量組比較，滌痰湯高劑量組NF-кB表達量顯著下降(P<0.05)。見表2、圖2。

表2 各組海馬NF-кB表達灰度及TNF-α相對表達量比較

圖2 各組海馬NF-кB蛋白表達比較(DAB，×400)

2.4海馬組織TNF-α表達水平 與假手術組比較，模型組TNF-α的表達量明顯增高(P<0.01)；與模型組比較，滌痰湯低劑量組、滌痰湯高劑量組TNF-α表達量顯著下降(P<0.05，P<0.01)；與滌痰湯低劑量組比較，滌痰湯高劑量組TNF-α表達量顯著下降(P<0.05)。見表2、圖3。

圖3 各組海馬TNF-α蛋白的表達

2.5海馬組織IL-1β、IL-10含量檢測結果比較 與假手術組相比，模型組海馬組織勻漿IL-1β、IL-10含量顯著升高(P<0.01)；與模型組比較，滌痰湯低劑量組、滌痰湯高劑量組IL-1β含量降低(P<0.05，P<0.01)，IL-10含量顯著升高(P<0.05，P<0.01)；與滌痰湯低劑量組比較，滌痰湯高劑量組IL-10含量顯著升高(P<0.05)，IL-1β含量顯著下降(P<0.05)。見表3。

表3 各組海馬組織勻漿IL-1β、IL-10含量比較

3 討 論

VD屬于中醫學“文癡病”、“愚癡病”、“呆癡病”等疾病范疇，清代陳士鐸在《辨證錄》中說：“痰積于胸中，盤踞于心外，使神明不清而成呆病矣”，認為痰濁在癡呆的發病中具有關鍵作用。其所創立的治呆諸方皆以逐痰健脾為要。現代學者通過臨床研究發現VD患者的認知障礙與中醫痰濁密切相關〔2,3〕。作為中醫治療癡呆的經典方劑滌痰湯，可逐痰開竅、安神定志治療癡呆。本實驗研究表明滌痰湯可改善VD大鼠的認知功能障礙，保護VD大鼠海馬神經元。這與我們的前期臨床研究結果相一致〔4,5〕。作為VD的重要病理學基礎，慢性腦缺血可引起腦組織炎癥反應，損傷大腦神經元導致認知功能下降〔6～8〕。腦缺血發生后，局部內皮細胞、神經元等被激活，釋放IL-1β、TNF-α等炎性因子，進一步刺激其他炎性因子的釋放，并誘導炎癥細胞進入損傷的腦組織，引發炎癥級聯反應，造成神經元損傷〔9,10〕，引起認知障礙。本實驗表明IL-1β、TNF-α參與了VD大鼠海馬缺血損傷，導致了認知障礙；滌痰湯可能通過抑制IL-1β、TNF-α的表達減輕海馬神經元損傷從而改善認知障礙。IL-1β、TNF-α等炎性因子也參與調節突觸可塑性，與VD的發病密切相關〔11,12〕。NF-кB是炎癥反應中重要的核轉錄因子。腦缺血時，IL-1β、TNF-α等刺激NF-кB迅速活化，后者進入細胞核內，與多種炎性反應基因的啟動子結合，促進炎性因子的表達，引起海馬區炎癥反應，損傷神經元〔13,14〕，引起海馬損傷及神經元-突觸丟失，最終導致認知障礙〔15〕。本實驗表明VD的缺血損傷可能導致NF-кB的活化，促進海馬組織炎癥反應。經滌痰湯治療后NF-кB的表達下降，表明滌痰湯可能通過抑制NF-кB的表達緩解海馬組織炎癥提高認知水平。IL-10作為腦缺血后小膠質細胞產生的抗炎因子〔16〕，可通過抑制缺血后的炎癥反應發揮神經保護作用〔17〕，研究表明調高IL-10的表達與改善缺血后認知障礙密切相關〔18〕。本實驗中，模型組IL-10的表達較假手術組升高，體現了IL-10的保護效果，但其仍不足以對抗其他眾多促炎因子的作用，導致抑炎因子與促炎因子之間的動態平衡被打破和炎癥反應的發生。在給予滌痰湯后，VD大鼠海馬組織中IL-10的含量升高，進一步增強了抑炎因子的作用，緩解了大鼠海馬組織的損傷，改善VD大鼠認知障礙。