高產酸本土非釀酒酵母菌株的篩選及發酵性能研究

董琦楠，葉冬青，梁艷英，姜 嬌，劉延琳，3*

（1.西北農林科技大學 葡萄酒學院，陜西 楊凌 712100；2.廣西壯族自治區農業科學院 果蔬貯藏與加工新技術重點實驗室，廣西 南寧 530007；3.西北農林科技大學 寧夏賀蘭山東麓葡萄酒試驗示范站，寧夏 永寧 750104）

近年來，我國西部葡萄酒產區葡萄原料糖分過高、酸度過低的現象愈發突出，因此，導致所釀造的葡萄酒口感風味不平衡[1]，葡萄酒色澤變暗[2]，易遭到微生物的污染[3]。如何提高葡萄酒酸度，突出葡萄酒典型性風格特征，已成為我國西部地區葡萄酒釀造急需解決的問題。目前較為普遍的增酸方法包括物理增酸、化學增酸及生物增酸三類[4-7]。化學方法主要通過添加酒石酸調節葡萄酒的酸度，但這可能會引起酒石酸沉淀[3]，進而對葡萄酒產生復雜影響，而且添加量受到法律的嚴格限制[8]。物理方法增酸主要是采用離子交換法，其價格昂貴，且易引入大量其他離子[7]。生物增酸使葡萄酒穩定性高、口感柔和，成為理想的增酸方法。

隨著近年來對非釀酒酵母（non-Saccharomyces）研究的不斷深入，發現葡萄酒在發酵過程中可利用非釀酒酵母產生乳酸，使其口感柔和，性質穩定[9]。非釀酒酵母用于葡萄酒生物增酸具有極大潛力，逐漸成為近年來的研究熱點[10-12]。有研究發現，耐熱克魯維酵母（Lachancea thermotolerans）及葡萄汁有孢漢遜酵母（Hanseniaspora uvarum）能夠提高葡萄酒的酸度、降低pH值，同時也能夠增加葡萄酒的香氣[13-16]，其有較強的發酵能力，對酒精、SO2耐受性較高[17-18]。

本研究以25株本土非釀酒酵母（18株耐熱克魯維酵母、7株葡萄汁有孢漢遜酵母）為研究對象，將其在酵母浸出粉胨葡萄糖培養基（yeast extract peptone dextrose，YPD）10、Triple M改良模擬汁中進行發酵，測定產酸能力，篩選增酸菌株，并對所篩選菌株的乙醇、SO2、糖及pH耐受性進行研究，最后利用篩選菌株對葡萄汁進行發酵，進而篩選能夠有效增加葡萄酒酸度的優良本土非釀酒酵母菌，以期為非釀酒酵母在發酵低酸葡萄汁中的應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株本研究所用實驗菌株的類型及來源見表1。

表1 本研究所用實驗菌株類型及來源Table1 Types and origins of test strains used in the study

1.1.2 試劑

酒石酸、蘋果酸、檸檬酸（均為分析純）：阿拉丁試劑（上海）有限公司；精氨酸、脯氨酸、色氨酸（純度99.85%）：北京索萊寶科技有限公司；L-乳酸試劑盒、D-乳酸試劑盒：愛爾蘭Megazyme公司。其他試劑均為國產分析純或生化試劑。

1.1.3 培養基

YPD培養基[19]：葡萄糖10 g/L，蛋白胨20 g/L，酵母浸粉10 g/L，自然pH，121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。

YPD10液體培養基[20]：葡萄糖100 g/L，蛋白胨20 g/L，酵母浸粉10 g/L，自然pH，121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。

Triple M改良模擬汁[21]：將ergo stock（12.5 mL Tween80，37.5 mL體積分數95%乙醇，0.125 g麥角固醇）、溶液A（375 mL去離子水中加125 g葡萄糖，125 g果糖，4 mL ergo stock，溶解后加入去離子水補充到500 mL）、溶液B（250 mL去離子水中加6 g酒石酸，3 g蘋果酸，0.5 g檸檬酸）、溶液C（250 mL去離子水中加入1.7 g無氨基酵母氮源（yeast nitrogen base without amino acids，YNB），2 g水解酪蛋白，6 mg肌醇，0.2 g無水氯化鈣，0.8 gL-精氨酸，1 gL-脯氨酸，0.1 g色氨酸，1 g磷酸銨）混合后，用氫氧化鉀調pH至3.25，過濾除菌，現配現用。

1.2 儀器與設備

UV-Vis Cary60紫外分光光度計：美國安捷倫公司；ZHWY-2102C恒溫培養振蕩器：上海智城分析儀器制造有限公司；TG16-WS臺式高速離心機：長沙湘儀離心機儀器有限公司；BK1301生物顯微鏡：重慶光電儀器有限公司；Agilent 1260 Infinity II高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）儀：美國安捷倫公司；87H+液相色譜柱（300 mm×7.8 mm，9 μm）：美國Bio Rad公司。

1.3 方法

1.3.1 本土非釀酒酵母菌株在YPD10培養基中的發酵實驗

以商業耐熱克魯維酵母CT10及商業釀酒酵母NX11424為對照，取-20 ℃甘油保藏的菌液50 μL于含4 mL YPD培養基的試管中，在28 ℃、150 r/min條件下活化培養24 h。將活化好的菌株以105CFU/mL的接種量接種到20 mL YPD10液體培養基（初始pH值5.8）中，在28 ℃、150 r/min的條件下發酵60 h，取樣。將樣品以8 000 r/min離心2 min后取上清液，測定乳酸（L-乳酸及D-乳酸）含量及pH值，并計算pH降低值（ΔpH），以進行高產乳酸菌株的初步篩選。

1.3.2 本土非釀酒酵母菌株在Triple M改良模擬汁中的發酵實驗

以商業耐熱克魯維酵母CT10為對照，將上一步篩選出的非釀酒酵母進行活化，將活化好的菌株以105CFU/mL的接種量接種到20 mL Triple M改良模擬汁（初始pH為3.25，還原糖含量為250 g/L，可滴定酸含量為8.97 g/L）中，在28 ℃，150 r/min的條件下進行發酵。每24 h稱質量以測定其CO2質量損失，當連續3 d CO2質量損失均在0.1 g以下，則發酵結束。對發酵結束的樣品進行取樣，將樣品以8 000 r/min離心2 min后取上清液，測定酒精度、殘糖量、pH值、可滴定酸、揮發酸、乳酸及蘋果酸含量。

1.3.3 菌株耐受性研究

以YPD培養基為基礎培養基，分別添加不同體積分數的乙醇（3%、6%、9%、12%、15%）、不同質量濃度的SO2（以H2SO3形式添加）（60 mg/L、120 mg/L、180 mg/L、240 mg/L、300mg/L、360mg/L）、不同質量濃度的葡萄糖（200g/L、250g/L、300 g/L、350 g/L、400 g/L），調成不同的pH值（pH2.8、pH3.2、pH3.6、pH3.8），將處于對數生長期的所篩選菌株分別以105CFU/mL的接種量接種于不同培養基中進行耐受性試驗，在28 ℃條件下靜置培養24 h，在波長600 nm處測定吸光度值（OD600nm值），分別繪制菌株乙醇耐受性、SO2耐受性、糖耐受性、pH耐受性曲線。

1.3.4 菌株的葡萄汁發酵實驗

將活化好的菌株以105CFU/mL的接種量接種到100 mL經除梗破碎低溫浸漬24h后的葡萄汁（初始糖含量為280.45g/L，pH值為3.31，可滴定酸含量為5.08g/L，蘋果酸含量為1.35 g/L）中，在28 ℃、150 r/min的條件下進行發酵。每天稱質量以測定其CO2質量損失，當連續3 d CO2質量損失均在0.1 g以下，則發酵結束。對發酵結束的樣品進行取樣，以8 000 r/min離心2 min后取上清液，測定殘糖量、pH值、酒精度、可滴定酸、乙酸、乳酸及蘋果酸含量。

1.3.5 分析檢測

酒精度、可滴定酸含量、pH和揮發酸含量的測定：參照國標GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》；殘糖量的測定：采用3,5-二硝基水楊酸（3,5-dinitrosalicylic acid，DNS）法[22]；CO2質量損失的測定：稱重法；根據CO2質量損失計算CO2質量損失速率，其計算公式：（后一天CO2質量損失-前一天CO2質量損失）×50/24；L-乳酸和D-乳酸含量的測定：采用試劑盒法及高效液相色譜法[23]。

1.3.6 數據處理

采用Excel 2019進行數據處理統計；采用SPSS 21.0對數據進行單因素方差分析，利用Duncan's多重比較在置信區間0.05下對數據進行差異顯著性分析；采用Origin 2018軟件作圖。每個實驗重復3次，結果用“平均值±標準差”表示。

2 結果與分析

2.1 YPD10液體培養基發酵實驗

27株酵母菌在YPD10液體培養基發酵60 h時，發酵液中乳酸含量及ΔpH見表2。

由表2可知，各菌株在YPD10液體培養基中發酵60 h時，其發酵液中均能夠檢測到乳酸，且在大部分的酵母發酵液中，L-乳酸的生成量大于D-乳酸。其中本土非釀酒酵母菌HU3的乳酸產量最高（7.77 g/L），是商業耐熱克魯維酵母CT10（1.68 g/L）的3.63倍。對總乳酸量及ΔpH進行相關性分析，結果發現總乳酸量與ΔpH顯著相關（P＜0.05），且相關系數R2為0.894，說明乳酸的增加對pH的降低起到顯著作用。最終，在所有菌株中，以總乳酸產量＞3 g/L、ΔpH＞1為篩選條件，篩選出9株耐熱克魯維酵母（LT1、LT6、LT8、LT10、LT11、LT13、LT15、LT17、LT18）、6株葡萄汁有孢漢遜酵母（HU1、HU2、HU3、HU4、HU6及HU7），共計15株菌。

表2 27株酵母菌株在YPD10液體培養基中發酵60 h時的乳酸產量及ΔpHTable2 Lactic acid content and ΔpH of 27 yeast strains after fermentation 60 h in YPD10 liquid medium

2.2 Triple M模擬葡萄汁發酵實驗

15株本土非釀酒酵母及商業耐熱克魯維酵母CT10的Triple M模擬汁發酵液的理化指標檢測結果見表3。

表3 Triple M模擬汁發酵液理化指標的檢測結果Table3 Determination results of physical and chemical indexes of Triple M simulated juice fermentation broth

酵母菌在發酵過程中對糖的轉化能力可以由發酵液中的殘糖量反映，發酵結束后，若殘糖量低，則表明酵母發酵徹底，對糖的利用能力高，發酵能力強[24]。由表3可知，15株本土非釀酒酵母的Triple M模擬汁發酵液中殘糖量均＞20 g/L，其中，菌株HU1的Triple M模擬汁發酵液中殘糖量高達168 g/L，表明非釀酒酵母對糖的利用能力較弱，這也是實際生產中通常將釀酒酵母與非釀酒酵母混合發酵的一個重要原因[25]。

Triple M模擬汁中所測得的乳酸含量均為凈生成量。各試驗菌株的Triple M模擬汁發酵液中乳酸含量＞1 g/L的菌株有5株，分別是菌株LT1、LT13、HU3、HU4以及HU7，其中菌株HU7生成的乳酸含量最高，達到2.17 g/L。同時，菌株LT13、HU3、HU4及HU7的Triple M模擬汁發酵液中的蘋果酸含量均＞2 g/L，說明這4株試驗菌株降解蘋果酸能力較弱，能夠優先將糖轉化為乳酸。而菌株LT1的Triple M模擬汁發酵液中蘋果酸降解率達到77.33%，說明蘋果酸降解也是其乳酸生成的重要原因。對比可滴定酸含量結果可知，在上述4株非釀酒酵母中，除了菌株LT13的Triple M模擬汁發酵液中的可滴定酸含量略有降低外，其他3株非釀酒酵母的Triple M模擬汁發酵液的可滴定酸均呈現上升趨勢。所有酵母的Triple M模擬汁發酵液中的揮發酸含量均低于GB 15037—2006《葡萄酒》中所規定的要求。

綜合分析，試驗菌株HU7、LT1、LT13、HU3以及HU4的產乳酸能力較強，能在一定程度上降低發酵液中的pH，同時具有較好的發酵特性，對其進行耐受性試驗測試。

2.3 菌株耐受性研究

2.3.1 乙醇耐受性

以商業耐熱克魯維酵母CT10為對照菌株，5株篩選菌株的乙醇耐受性見圖1。

圖1 篩選菌株對乙醇的耐受性Fig.1 Tolerance of screening strains to ethanol

由圖1可知，5株非釀酒酵母的OD600nm值隨著乙醇體積分數的升高而呈現下降趨勢。當乙醇體積分數為3%時，5株酵母的OD600nm值均＞1.0；當乙醇體積分數升至15%時，它們仍能生長。其中菌株HU7與HU4在體積分數為6%的乙醇條件下，OD600nm值開始有明顯降低；隨著乙醇體積分數的增加，OD600nm值緩慢降低到0.5以下，這表明過高體積分數的乙醇對菌株生長有明顯的抑制作用。菌株LT13在乙醇體積分數升至12%時，OD600nm值才明顯下降。菌株HU3的OD600nm值則隨著乙醇體積分數的上升呈現持續下降，表明菌株HU3對于乙醇更加敏感。而菌株LT1的OD600nm值在乙醇體積分數為15%時才有明顯的下降趨勢，表明其對乙醇的耐受能力較強。總體而言，菌株LT1對乙醇的耐受能力最強，而菌株LT13的耐受能力與商業對照菌株CT10相似。

2.3.2 SO2耐受性

葡萄酒生產過程中，加入適量SO2能起到殺菌，抑制葡萄汁中有害微生物，抗氧化及護色等作用[24]。以商業耐熱克魯維酵母CT10為對照菌株，5株篩選菌株的SO2耐受性見圖2。由圖2可知，在未加入SO2的培養基中，各菌株的OD600nm值均＞1.0，加入質量濃度為60 mg/L的SO2后，各菌株的OD600nm值迅速降低至1.0以下，但其在含質量濃度為60～360 mg/L的SO2的YPD培養基中均能生長，且與商業對照菌株CT10對SO2的耐受性相似。其中，菌株LT1的耐受性最好。這說明5株非釀酒酵母能夠耐受正常葡萄酒生產過程中的SO2濃度（60 mg/L）。

圖2 篩選菌株對SO2的耐受性Fig.2 Tolerance of screening strains to SO2

2.3.3 糖耐受性

在葡萄酒生產過程中，糖是酵母生活的能源物質，但是高濃度的糖會抑制酵母的生長，造成葡萄糖代謝阻遏，并且高滲透壓會引起酵母細胞水分的流失，使其活性降低[26]。以商業耐熱克魯維酵母CT10為對照菌株，5株篩選菌株的糖耐受性見圖3。由圖3可知，5株非釀酒酵母的OD600nm值均隨著葡萄糖質量濃度的升高而降低。當葡萄糖質量濃度為400 g/L時，菌株LT1、LT13及CT10的OD600nm值仍維持在1.0以上，這說明菌株對于糖環境的適應性較好，耐受性強。其中菌株LT1的糖耐受性最好，菌株LT13的糖耐受性與商業對照酵母CT10相似。

圖3 篩選菌株對糖的耐受性Fig.3 Tolerance of screening strains to sugar

2.3.4 pH值耐受性

高酸可以抑制敗壞酵母的生長，防止葡萄酒的污染，但過低的pH同樣會影響酵母生長，通常葡萄酒發酵中的pH值在3.2左右[2]。以商業耐熱克魯維酵母CT10為對照菌株，5株篩選菌株的pH耐受性見圖4。由圖4可知，隨著pH值的降低，菌株LT13、HU7、HU4及CT10的OD600nm值緩慢降低，表明其在pH為3.8的環境中生長最好。而菌株HU3和LT1在pH為3.6時OD600nm值達到最高（分別為1.81和1.18），表明其最適pH為3.6。與商業對照酵母CT10相比，菌株HU3和LT1對不同pH環境下的耐受性更好，其中HU3的pH耐受性最好。

圖4 篩選菌株的pH耐受性Fig.4 Tolerance of screening strains to pH value

2.4 菌株發酵葡萄汁性能測定結果

以商業耐熱克魯維酵母CT10為對照菌株，5株篩選菌株發酵葡萄汁過程中，CO2質量損失速率見圖5。由圖5可知，6株試驗菌株在葡萄汁的發酵中有一定的延滯期，這可能是由于葡萄汁中的環境因素較為復雜。其中菌株LT1在發酵時間為48 h進入發酵旺盛期；菌株LT13和菌株HU4在發酵時間為72 h進入發酵旺盛期；菌株HU7和菌株CT10在發酵時間為96 h進入發酵旺盛期；菌株HU3在144 h進入發酵旺盛期。其中菌株LT1及HU4的CO2質量損失速率最高，均＞0.8 g/（L·h）。

圖5 發酵過程中葡萄汁的CO2質量損失速率曲線Fig.5 CO2 weight loss rate curve of grape juice during fermentation

發酵結束后，各酒樣的理化指標見表4。由表4可知，發酵后酒樣中殘糖量范圍在55.27～89.55 g/L之間，均未能發酵完全。其酒精度均＞11%vol，結合耐受性結果，大約12%vol的酒精度已經對菌株有較為明顯的抑制作用，這可能是菌株未能將糖消耗完的一個重要原因。試驗菌株HU3、HU4、HU7及LT1發酵葡萄汁酒樣中乳酸的產量顯著高于對照菌株CT10酒樣，說明這4株酵母菌在葡萄汁中依然具有穩定的產乳酸能力，其中菌株HU7酒樣的可滴定酸含量高于其他實驗組，增酸效果較好。所有酵母菌發酵的酒樣中揮發酸含量均低于GB 15037—2006《葡萄酒》中的要求。綜上分析，菌株LT1及HU4在葡萄汁中產乳酸能力較好，能耐受較差的脅迫環境，有較強的發酵特性，具備釀造增酸葡萄酒的潛力。

表4 菌株發酵葡萄汁樣品理化指標的檢測結果Table4 Determination results of physical and chemical indexes of grape juice fermented by strains

3 結論

本實驗通過對25株本土非釀酒酵母在YPD10及模擬汁中發酵性能的研究，初步選出產酸量較高的菌株LT1、LT13、HU3、HU4以及HU7，對其進行耐受性測試及葡萄汁發酵實驗。結果表明，非釀酒酵母LT1及HU4的產酸性能良好，對乙醇、SO2、糖和pH綜合耐受性較好，其中菌株LT1能耐受體積分數12%的乙醇、400 g/L的糖及2.75的低pH脅迫，菌株HU4能耐受體積分數6%的乙醇、250 g/L的糖及2.75的低pH脅迫。菌株LT1和HU4在葡萄汁中啟酵時間較短，發酵旺盛期CO2質量損失速率均＞0.8 g/（L·h）。菌株LT1和HU4乳酸產量分別為0.93 g/L、1.14 g/L，乙酸產量分別為0.38 g/L、0.42 g/L，具備釀造增酸葡萄酒的潛力。