高產乙酸乙酯酵母菌的篩選及其在清香型小曲白酒生產中的應用

許 銀，楊 強，張 龍，陳佳興，劉源才，陳 凱，程學勛，陳申習*

（1.勁牌有限公司 勁牌研究院 中藥保健食品質量與安全湖北省重點實驗室，湖北 黃石 435000；2.宜賓六尺巷酒業有限公司，四川 宜賓 644000）

酯類物質作為一種具有芳香性氣味的易揮發性化合物，大多具有水果香味，廣泛存在于各類香型白酒中，對于協調白酒的香氣和提升口感具有重要的作用[1-3]。在眾多酯類物質中，以乙酸乙酯研究較多，特別是在清香型白酒研究領域[4-7]?，F有研究表明，乙酸乙酯是清香型白酒的主體呈香物質，對清香型白酒風格的形成具有重要作用，決定著清香型白酒的質量分級[8-9]。

清香型白酒中乙酸乙酯的產生，是生香酵母以及酶催化作用形成的[10-11]。產酯能力較強的酵母包括畢赤酵母屬（Pichia）、漢遜酵母屬（Hansenula）、假絲酵母屬（Candida）等[12-14]。目前，作為清香型白酒的重要分支，清香型小曲白酒中乙酸乙酯含量相對較低。原因在于白酒發酵過程中氧氣的快速消耗，與產酯有關的大多數酵母代謝能力大幅減弱。同時，由于環境因子的脅迫，產酯酵母數量急劇下降，從而導致小曲白酒中乙酸乙酯含量不足。近年來，許多白酒企業嘗試延長發酵周期或者在蒸餾時添加乙酸乙酯，來提高成品酒中乙酸乙酯含量，這雖取得了一定效果，但在實際運用中受到很多限制。白酒發酵中的微生物可產生乙酸乙酯，所以要從根本上提升乙酸乙酯含量，還需從菌株自身發酵性能方面開展工作[15-18]。

本研究從濃香型大曲中分離純化酵母菌，結合形態學觀察和分子生物學鑒定，經過高粱汁發酵初篩、固態發酵復篩，以獲得高產乙酸乙酯的酵母菌，并將其應用于清香型小曲白酒工業生產。這對于提升發酵后原酒中乙酸乙酯含量，提高清香型小曲白酒的口感和品質，滿足消費者對高品質白酒的需求具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

濃香型大曲：四川宜賓六尺巷酒業有限公司；東北粳高粱：黑龍江大慶；麩皮：河南飛天農業開發股份有限公司。

1.1.2 化學試劑

β-淀粉酶（酶活50 000 U/g）、糖化酶（酶活100 000 U/g）：無錫雪梅酶制劑科技有限公司；真菌基因組脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）提取試劑盒：上海生工生物技術服務公司；DNA凝膠回收試劑盒：美國AXYGEN公司；乙醛、甲醇、正丙醇、乙酸乙酯等標準品（均為色譜純）：中國醫藥集團有限公司；硫酸（分析純）：中國醫藥集團有限公司。Q5高保真DNA聚合酶：美國NEB公司；聚合酶鏈式反應（polymerasechainreaction，PCR）緩沖液、脫氧核糖核苷三磷酸（deoxyribonucleoside triphosphate，dNTP）混合液、引物ITS1和ITS4：寶日醫生物技術（北京）有限公司。

1.1.3 培養基

華倫斯坦實驗室（Wallestein laboratory，WL）營養瓊脂培養基[19]：葡萄糖50 g/L，酵母浸粉4 g/L，蛋白胨5 g/L，硫酸鎂0.125 g/L，磷酸二氫鉀0.55 g/L，氯化鉀0.425 g/L，氯化鈣0.125g/L，硫酸錳0.002 5 g/L，氯化鐵0.002 5 g/L，溴甲酚綠0.022g/L（滅菌后添加），瓊脂20 g/L，青霉素0.1 g/L，調節pH為6.5，121 ℃滅菌20 min。酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YPD）培養基[19]：酵母提取物10 g/L，葡萄糖20 g/L，蛋白胨20 g/L，青霉素0.1 g/L。固體培養基添加瓊脂粉20 g/L。121 ℃滅菌30 min。

高粱汁培養基[19]：高粱200 g經粉碎后，加蒸餾水800 mL，然后添加β-淀粉酶10 g和糖化酶10 g，置于60 ℃恒溫箱中糖化24 h，經過濾得濾液，濾液糖度調整為10°Bx。

高粱固體培養基：取1 kg粳高粱放置不銹鋼容器中，添加溫度為60 ℃的蒸餾水沒過高粱表面，培養箱控制溫度為60 ℃，浸泡18 h，然后瀝干泡糧水，用抹布包裹高粱進行初蒸（121 ℃、30 min）、燜糧（80 ℃、40 min）、復蒸（115 ℃、15 min），即為高粱固體培養基。

麩皮培養基：取一定質量麩皮，添加蒸餾水，使得含水量在45%～50%之間，于121 ℃滅菌45 min。

1.2 儀器與設備

AL204電子分析天平：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；JJ1000電子天平：常熟雙杰測試儀器廠；SFG-02B電熱恒溫鼓風干燥箱：上海精宏實驗設備儀器廠；QYC-200全溫空氣搖床：上海?，攲嶒炘O備有限公司；YXQ-LS-75S蒸汽滅菌鍋、SPX-100B-Z生化培養箱：上海博訊實業有限公司；5424R艾本德小型離心機：艾本德（中國）儀器有限公司；YPZQ-45圓盤制曲機：煙臺良榮機械精業有限公司；BCM-1600A潔凈工作臺：蘇州安泰空氣技術有限公司；Nikon ECLIPSE E200顯微鏡：日本Nikon公司；Agilent 7890A型氣相色譜（gas chromatography，GC）儀（配有氫火焰檢測器和7863型自動進樣器）：美國安捷倫公司；2720型PCR儀：美國ABI公司；DYY-6C型電泳儀：北京六一儀器廠；BG-gdsAUTO（130）凝膠成像系統：北京百晶生物科技有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 酵母菌的分離純化[20]

將濃香型大曲樣品用粉碎機粉碎后，制成粉狀備用。稱取曲粉5 g，放入盛有95 mL無菌水并帶有玻璃珠的250 mL三角瓶中，30 ℃、200 r/min條件下振蕩培養30 min，制成菌懸液。按10倍梯度系列將菌懸液稀釋至10-4，取稀釋度為10-1、10-2、10-3和10-4的曲粉溶液0.2 mL分別涂布于WL營養瓊脂培養基中，于30 ℃條件下培養24～48 h后，挑取單菌落劃線于YPD培養基上，30 ℃條件下培養48 h。經過2～3次平板劃線后得到初步純化的菌落，4 ℃保存，備用。

1.3.2 酵母菌的鑒定

（1）形態觀察

參考《真菌鑒定手冊》對菌落的顏色、透明度、大小等特征及細胞形態進行描述分類[21]。

（2）分子生物學鑒定

采用DNA提取試劑盒提取酵母菌的基因組DNA，以其為模板，采用真菌通用引物ITS1（5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'）和ITS4（5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'）對其ITS區基因序列進行PCR擴增。PCR擴增體系（25 μL）：PCR緩沖液10 μL，dNTP混合液（2.5 mmol/L）2 μL，引物ITS1（10 μmol/L）1 μL，引物ITS4（10 μmol/L）1 μL，真菌DNA模板2 μL，超純水8.75 μL，Q5 DNA聚合酶0.25 μL。PCR擴增條件：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性30 s，52 ℃退火40 s，72 ℃延伸60 s，共35個循環；72 ℃再延伸10 min。PCR擴增產物經2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，純化后送華大基因（武漢）測序公司測序。將測序結果提交至美國國家標準技術研究所（national institute of standards and technology，NIST）的GenBank數據庫中，采用基本局部比對搜索工具（basic local alignment search tool，BLAST）進行同源性搜索，選取同源性較高的模式菌株的ITS基因序列，采用MEGA 6.0中的鄰接（neighbor-joing，NJ）法構建系統發育樹。

1.3.3 酵母菌的液態發酵實驗

把分離純化后的單菌落接種于含有10 mL YPD液態培養基的無菌試管中，30 ℃、150 r/min條件下振蕩培養48 h，吸取0.4 mL菌液接種于含有50 mL高粱汁培養基的250 mL三角瓶發酵栓中，以不接種任何菌液的高粱汁培養基為空白對照，以市售常用產酯酵母Y0為陽性對照。樣品于30 ℃生化培養箱恒溫培養，每隔24 h小心振蕩發酵栓并稱質量，當質量損失＜0.2 g時，停止培養。將培養后的發酵液離心（20 ℃，8 000 r/min）、過濾后，取發酵液，采用氣相色譜檢測乙酸乙酯及雜醇（異丁醇、異戊醇）含量[22]。

1.3.4 酵母菌麩皮種的制作

酵母菌麩皮種的制作：將篩選得到的酵母菌接種于含有5 mL YPD培養基的試管中，30 ℃、150 r/min振蕩培養24 h，然后接入無菌的200 mL YPD液態培養基中，30 ℃、150 r/min培養24 h后作為種子液。按照每g麩皮培養基接種0.5 mL種子液（酵母數量為1×107CFU/mL）進行接種，30 ℃培養36 h，將麩皮培養物35 ℃條件下干燥6～8 h，即得酵母菌麩皮種。

酵母麩皮種的擴大培養：采用圓盤制曲機生產。按照上述比例將酵母種子液接種于麩皮培養基，啟動溫控系統自動控制圓盤溫度在30～32 ℃之間，培養32 h后，出盤干燥，然后粉碎，檢測細胞數＞10×108CFU/g為合格。

1.3.5 酵母菌的固態發酵實驗

將酵母菌麩皮種，按照質量分數5%添加到勁牌小曲中，以添加市售酵母Y0的勁牌小曲為陽性對照，不添加菌株的勁牌小曲樣品為空白對照，在無菌實驗室模擬清香型小曲白酒生產工藝條件[23-24]，具體操作工藝流程：泡糧（60 ℃，20 h）、初蒸（121 ℃，30 min）、燜糧（60 ℃，1 h）、復蒸（115 ℃，15 min）、撒曲（1%）、糖化（24 h）、發酵（7 d）。蒸糧結束后，熟糧完全透心，一致性好，水分含量在55%左右；稱取糖化醅500 g與配糟（配糟采用車間大生產蒸餾后的鮮糟）按質量比1∶1混勻后入瓶，瓶塞上裝2.5 mol/L硫酸密封，在培養箱中30 ℃發酵7 d。發酵結束后，采用固態蒸餾，取100 mL蒸餾液，采用氣相色譜檢測乙酸乙酯含量[22]。

1.3.6 酵母菌強化酒曲在清香型小曲白酒生產中的應用

采用圓盤制曲機生產出酵母菌麩皮種與車間酒曲進行配比優化，酵母麩皮種按質量比為3∶100添加到酒曲中，制備成車間實驗用曲，以不加菌酒曲為空白對照，按清香型小曲白酒車間生產工藝進行中試生產。清香型小曲白酒車間生產工藝：泡糧（75 ℃，17 h）、初蒸（0.12 MPa，30 min）、燜糧（60 ℃，1 h）、復蒸（0.04 MPa，15 min）、加曲（1%）、糖化（22 h）、發酵（14 d）。中試生產每次投糧1 000 kg，發酵結束后經固態蒸餾即得小曲原酒，取100 mL原酒，采用氣相色譜檢測揮發性風味物質[22]，并進行感官評價。

1.3.7 出酒率的計算

在20 ℃條件下，求得已折算為乙醇體積占比55%的原酒質量，即為原酒產量，計算出單位投糧量的原酒產量即為出酒率[25-26]。

1.3.8 清香型小曲白酒的感官評價

邀請勁牌公司5位國家級白酒評委，參照國家標準GB/T 33404—2016《白酒感官品評導則》對白酒進行感官評價[27]，滿分為100分。

1.3.9 數據處理

每個實驗重復三次，結果用“平均值±標準差”表示。采用SPSS 19.0分析軟件對數據進行標準差及顯著性分析，P＜0.05說明差異顯著[18]。

2 結果與分析

2.1 酵母菌的分離及形態特征

從濃香型大曲中分離純化得到2株菌落形態不同的菌株，分別編號為Y87和Y88。其菌落及細胞形態見圖1。

圖1 菌株Y87（a）與菌株Y88（b）的菌落及細胞形態Fig.1 Colony and cell morphology of strains Y87 (a) and Y88 (b)

由圖1可知，菌株Y87的菌落較大，呈白色，表面光滑，無光澤；細胞呈圓形。菌株Y88的菌落較大，呈白色，表面光滑凸起，有光澤；細胞呈圓形或橢圓形。根據《真菌鑒定手冊》[21]，初步鑒定這兩株菌為酵母菌。

2.2 酵母菌的分子生物學鑒定

基于ITS rDNA基因序列構建菌株Y87及Y88的系統發育樹，結果見圖2。

圖2 基于ITS rDNA基因序列菌株Y87與Y88的系統發育樹Fig.2 Phylogenetic tree of strains Y87 and Y88 based on ITS rDNA gene sequences

由圖2可知，菌株Y87與異常威克漢姆酵母（Wickerhamomyces anomalus）聚于同一分支，親緣關系最近；菌株Y88與釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）聚于同一分支，親緣關系最近。結合形態學觀察，將菌株Y87鑒定為異常威克漢姆酵母（Wickerhamomyces anomalus），菌株Y88鑒定為釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）。

2.3 酵母菌的液態發酵實驗結果

酵母菌在高粱汁培養基中的發酵性能測定結果見表1。

表1 酵母菌在高粱汁培養基中的發酵性能測定結果Table1 Determination results of fermentation performance of yeasts in sorghum juice medium

由表1可知，酵母菌Y87發酵高粱汁后，CO2質量損失最高，為1.29 g，說明該酵母菌具有一定的產酒能力。從主要揮發性物質乙酸乙酯和雜醇產量來看，酵母菌Y87表現出了較好的產酯能力，乙酸乙酯產量（1.13 g/L）顯著高于市售酵母Y0（0.77 g/L）（P＜0.05）且菌株Y87產雜醇量較低（0.056 0 g/L），這對提升原酒品質，協調原酒口感具有促進作用。而菌株Y88產酒和產酯能力較弱。因此，選擇菌株Y87進行固態發酵試驗。

2.4 酵母菌Y87固態發酵實驗結果

將酵母菌Y87添加到酒曲后固態發酵得到的基酒中乙酸乙酯含量見表2。

表2 酵母菌固態發酵得到的基酒中乙酸乙酯含量測定結果Table2 Determination results of ethyl acetate contents in base liquor by yeast solid-state fermentation

由表2可知，菌株Y87固態麩皮種強化到小曲發酵7 d后，菌株Y87酒曲發酵得到的基酒中乙酸乙酯含量達到1.14 g/L，相比空白對照和陽性對照，含量分別提高79.4%和22.8%，表明應用菌株Y87可以顯著提高乙酸乙酯的生成量（P＜0.05），可改善原酒的風味。

2.5 菌株Y87強化酒曲在清香型小曲白酒生產中的應用

2.5.1 菌株Y87強化酒曲釀造白酒的揮發性風味物質

菌株Y87強化酒曲釀造白酒中揮發性風味物質測定結果見表3。由表3可知，相比空白對照，菌株Y87強化酒曲釀造白酒出酒率（61.4%）提高了1.2%，乙酸乙酯含量（1.38 g/L）提高36.6%，雜醇含量降低7.1%，正丙醇含量降低16.1%，可顯著提升白酒品質（P＜0.05）。

表3 菌株Y87強化酒曲釀造白酒揮發性風味物質測定結果Table3 Determination results of volatile flavor substances in Baijiu brewed by strain Y87 fortified Jiuqu

2.5.2 菌株Y87強化酒曲釀造白酒的感官評價

菌株Y87強化酒曲釀造白酒的感官評分為90.7分，高于空白對照白酒（89.9分），酒品具有清香型小曲白酒的入口醇甜、清香純正、尾較凈等特點，說明通過強化高產乙酸乙酯酵母于酒曲，并應用在清香型小曲白酒生產中，可以提升小曲白酒中風味物質含量。

3 結論

采用WL營養瓊脂培養基從濃香型大曲中分離純化得到2株酵母菌，編號為Y87、Y88，經形態觀察及分子生物學技術鑒定其分別為異常威克漢姆酵母（Wickerhamomyces anomalus）和釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）。經過液態高粱汁培養基、高粱固態發酵培養基發酵篩選得到菌株Y87為高產乙酸乙酯的酵母菌，高粱汁發酵乙酸乙酯產量達到1.13 g/L，高粱固態發酵乙酸乙酯產量達到1.14 g/L。將菌株Y87強化酒曲應用于清香型小曲白酒的釀造，白酒中乙酸乙酯含量提高36.6%，雜醇含量降低7.1%，正丙醇含量降低16.1%，感官評分為90.7分，具有小曲酒的典型特征，入口醇甜，清香純正。本研究有效地提升了勁牌公司原酒中呈香味物質乙酸乙酯含量，改善了原酒品質，可為發掘純天然菌株資源提供參考依據。