枯草芽孢桿菌發(fā)酵麥糟制備蛋白肽培養(yǎng)基研究

肖連冬，李慧星，于海彥，羅建成，程 爽

（1.南陽理工學院 生物與化學工程學院，河南 南陽 473000；2.河南省工業(yè)微生物資源與發(fā)酵技術重點實驗室，河南 南陽 473000）

麥糟是啤酒生產(chǎn)的主要副產(chǎn)物，含有豐富的非淀粉多糖和蛋白質[1-5]，其中麥糟中的蛋白質含量因大麥品種、麥芽制備及啤酒生產(chǎn)工藝等諸多因素的影響而不同，一般在12%～30%不等[6-7]，因此麥糟是一種良好的蛋白質資源，適合作為開發(fā)食品與保健品的原材料。我國是啤酒生產(chǎn)大國，2019年中國啤酒產(chǎn)量3.765×107kL[8]，以每千升啤酒產(chǎn)0.03 t干糟計，中國每年可產(chǎn)生約112.95萬t啤酒糟[9]，如此數(shù)量的寶貴資源，如充分加以開發(fā)利用，可以緩解我國蛋白質資源不足的問題。

麥糟蛋白肽是降解麥糟中蛋白質制得低分子質量、高活性的肽類[10]，其不僅具有優(yōu)良加工特性如溶解性、乳化性、起泡性、持水性等[11-12]，還具有抗疲勞、抗氧化、降血壓、降血糖、抗膽固醇和提高機體免疫力等生理活性[13-16]。科學研究證明，人體內(nèi)蛋白質消化后大都以小肽的形式吸收，比氨基酸更容易被人體吸收利用，具有更高的生物活性和營養(yǎng)價值[17]。因而，蛋白肽產(chǎn)品的生產(chǎn)已經(jīng)成為目前國際研究的熱門課題之一。目前，國內(nèi)外關于麥糟制備蛋白肽的研究尚不廣泛，多以酶法制備，水解程度低，成本比較高，采用枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）發(fā)酵麥糟制備蛋白肽未見報道。

本試驗利用枯草芽孢桿菌固態(tài)發(fā)酵技術，通過生物轉化生產(chǎn)麥糟蛋白肽，以麥糟作為氮源探討發(fā)酵制備麥糟蛋白肽培養(yǎng)基條件。著重考察麥糟發(fā)酵培養(yǎng)基碳源種類、碳源添加量、培養(yǎng)基料液比、拌料水pH值及磷酸二氫鉀添加量對麥糟發(fā)酵生產(chǎn)蛋白肽的影響，優(yōu)化培養(yǎng)基條件，以期為工業(yè)化生產(chǎn)麥糟活性肽提供技術參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗菌種

枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）：河南省工業(yè)微生物資源與發(fā)酵技術重點實驗室提供。

1.1.2 材料與試劑

麥糟：南陽市京德啤酒技術開發(fā)有限公司（干燥，粉碎過80目篩，粗蛋白含量18.35%）；耐高溫組培封口膜：常德比克曼生物科技有限公司；葡萄糖、蔗糖、氯化鈉（均為分析純）：天津市科密歐化學試劑有限公司；酒石酸鉀鈉（分析純）：天津市德恩化學試劑有限公司；硫酸銅、三氯乙酸、氫氧化鈉（均為分析純）：天津市致遠化學試劑有限公司；碘化鉀（純度＞99%）、牛肉膏、蛋白胨、瓊脂粉（均為生物試劑）：天津市永晟精細化工有限公司；牛血清白蛋白（色譜純）：北京奧博星生物技術有限責任公司；磷酸二氫鉀（分析純）：北京精求化工廠。

1.1.3 培養(yǎng)基

種子培養(yǎng)基：牛肉膏3 g/L，氯化鈉5.0 g/L，蛋白胨10 g/L，pH 7.2～7.4，121 ℃滅菌20 min。

發(fā)酵培養(yǎng)基：麥糟、碳源（淀粉/蔗糖/葡萄糖）、磷酸二氫鉀、水按一定比例配制。

1.2 儀器與設備

LDZW型立式壓力蒸汽滅菌鍋：上海申安醫(yī)療器械廠；SW-CJ-2G型雙人凈化工作臺：蘇州凈化設備有限公司；SPX-300-Ⅲ型生化培養(yǎng)箱：上海躍進醫(yī)療器械有限公司；MQD-A3型高精度三層疊加式振蕩培養(yǎng)箱：上海旻泉儀器有限公司；UV1600-759型紫外可見光分光光度計：上海菁化科技器材有限公司；TDL·40C型低速臺式大容量離心機：上海安亭科學儀器廠；PHS-3C型pH計：上海儀電科學儀器股份有限公司；DHG-9146A型電熱恒溫鼓風干燥箱：上海精宏實驗設備有限公司；BSA124S型分析天平：賽多利斯科學儀器（北京）有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 種子液制備

取1支活化菌種斜面，加入10 mL種子培養(yǎng)基，用接種環(huán)將斜面菌苔全部剝離洗下，搖勻；吸取2 mL接至已滅菌的20 mL種子培養(yǎng)基中，于36 ℃恒溫搖床120 r/min條件下培養(yǎng)8 h，獲得種子液。

1.3.2 麥糟蛋白肽發(fā)酵試驗

稱取麥糟樣品5.0 g置于250 mL三角瓶中，封口膜封口，包扎，121 ℃滅菌20 min；另取1支試管，根據(jù)麥糟與水的比加入所需的水量，然后加入一定比例的碳源及磷酸二氫鉀，溶解，調pH值，121 ℃滅菌20 min；待試管中溶液冷卻至室溫后，接入2 mL種子液，搖勻，制備成含菌拌料水，加入已滅菌的固體麥糟中，攪勻，置于恒溫培養(yǎng)箱中，37 ℃培養(yǎng)84 h。

1.3.3 發(fā)酵麥糟蛋白肽的萃取和測定

蛋白肽萃?。喝?00 mL蒸餾水加入發(fā)酵后的固態(tài)基質中，于磁力攪拌器上攪拌30 min，4 000 r/min離心10 min，收集上清液并定容至100 mL。取上清液5 mL，加入5 mL 10%三氯乙酸，搖勻后常溫靜置30 min，4 000 r/min離心15 min，得上清液備用。

蛋白肽測定：采用雙縮脲法[18]。取上清液1 mL，加入4 mL雙縮脲試劑，搖勻后常溫靜置30 min，測OD540nm值，根據(jù)蛋白肽測定回歸方程，得出蛋白質濃度，計算出總蛋白質量，按公式（1）計算肽得率：

1.3.4 麥糟蛋白肽發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化單因素試驗

以肽得率為考察指標，在其他條件相同時，分別考察不同碳源（淀粉、蔗糖、葡萄糖）、碳源添加量（3%、4%、5%、6%、7%）、料液比（1∶1、1∶1.5、1∶2、1∶2.5、1∶3（g∶mL））、磷酸二氫鉀添加量（0.1%、0.3%、0.5%、0.7%、0.9%）和拌料水pH值（5、6、7、8、9）對發(fā)酵結果的影響。每個試驗重復3次，結果取平均值。

1.3.5 麥糟蛋白肽發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化響應面試驗

在單因素試驗的基礎上，設計Box-Behnken試驗方案[19-20]進一步研究葡萄糖添加量（A）、料液比（B）、磷酸二氫鉀添加量（C）對肽得率的影響，考察因素的交互作用及顯著性，優(yōu)化培養(yǎng)基配方。響應面試驗因素水平及編碼見表1。

表1 培養(yǎng)基優(yōu)化響應面試驗因素與水平Table1 Factors and levels of response surface experiments for medium optimization

2 結果與分析

2.1 蛋白肽測定回歸方程擬合

取不同體積的牛血清蛋白標準溶液，按照樣品測定方法顯色，于波長540 nm下測定吸光度值，以蛋白質含量（x）為自變量，以吸光度值（y）為因變量，建立標準曲線，得到回歸方程y=0.041x+0.001（R2=0.999）。

2.2 麥糟蛋白肽發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化單因素試驗

2.2.1 碳源種類對肽得率的影響

碳源添加量5%，磷酸二氫鉀添加量0.5%，料液比1.0∶2.5（g∶mL），拌料水pH=7時，不同碳源對肽得率的影響見圖1。

圖1 碳源種類對肽得率的影響Fig.1 Effect of carbon sources on peptide yield

碳源為微生物生長提供碳架和能源，而麥糟中殘留總糖很低[21]，需要外加碳源來補充培養(yǎng)基中碳源不足，保證枯草芽孢桿菌正常生長代謝。由圖1可見，碳源種類對枯草芽孢桿菌發(fā)酵生產(chǎn)蛋白肽有明顯影響。三種碳源淀粉、蔗糖、葡萄糖中以葡萄糖作為碳源發(fā)酵效果最好，肽得率最高，蔗糖次之，淀粉因為較難利用對結果影響較小。通過對試驗數(shù)據(jù)的方差分析表明，葡萄糖對肽得率的影響顯著，因此，試驗確定在枯草芽孢桿菌發(fā)酵培養(yǎng)基中添加葡萄糖作為碳源。

2.2.2 葡萄糖添加量對肽得率的影響

當磷酸二氫鉀添加0.5%，料液比1.0∶2.5（g∶mL），拌料水pH=7時，葡萄糖添加量對肽得率的影響見圖2。

圖2 不同葡萄糖添加量對肽得率的影響Fig.2 Effect of different glucose addition on peptide yield

葡萄糖是微生物生長繁殖很重要的營養(yǎng)物質，在蛋白肽的發(fā)酵生產(chǎn)過程中，需要大量的碳源來維持其微生物細胞生長繁殖和產(chǎn)酶。由圖2可知，葡萄糖添加量對麥糟多肽發(fā)酵生產(chǎn)影響較大。當葡萄糖濃度較低時，肽得率隨葡萄糖添加量的增加而提高，當葡萄糖添加量為4%時，肽得率達到最高，隨著葡萄糖添加量的繼續(xù)增加肽得率逐漸下降。原因是過多的葡萄糖會加速菌體的呼吸作用，導致因溶氧不足而影響菌體的生長和產(chǎn)酶[22]；如果葡萄糖含量繼續(xù)增加超過限定后會因為高滲透壓造成細胞失水，抑制微生物的生長發(fā)酵，肽得率下降。試驗得出較佳葡萄糖添加量為4%。

2.2.3 料液比對肽得率的影響

在葡萄糖添加量5%，磷酸二氫鉀添加量0.5%，拌料水pH=7條件下，麥糟與水的料液比對肽得率的影響見圖3。

水是微生物與營養(yǎng)物質接觸的橋梁，培養(yǎng)基含水量的高低對微生物的生長及代謝有重要影響。對固態(tài)發(fā)酵而言，含水量低會影響物料基質的吸水膨脹，從而影響微生物對基質接觸代謝，含水量過高又會影響培養(yǎng)基內(nèi)溶氧和CO2的排出，微生物難以生長和產(chǎn)酶。由圖3可知，隨著加水量的增加，肽得率呈現(xiàn)先升后降趨勢，說明培養(yǎng)基含水量過高過低都不利于蛋白肽的發(fā)酵生產(chǎn)，試驗確定培養(yǎng)基的較好料液比為1.0∶2.0（g∶mL）。與袁建等[22]利用枯草芽孢桿菌固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)菜籽肽的研究一致，這可能與枯草芽孢桿菌的生長代謝特性有關。

圖3 不同料液比對肽得率的影響Fig.3 Effect of different solid-liquid ratio on peptide yield

2.2.4 磷酸二氫鉀添加量對肽得率的影響

在葡萄糖添加量5%，料液比1.0∶2.5（g∶mL），拌料水pH=7的條件下，磷酸二氫鉀添加量對枯草芽孢桿菌發(fā)酵麥糟生產(chǎn)蛋白肽的影響結果見圖4。

圖4 不同磷酸二氫鉀添加量對肽得率的影響Fig.4 Effects of different potassium dihydrogen phosphate addition on peptide yield

磷酸二氫鉀除了提供微生物代謝所需的P、K礦質營養(yǎng)元素外，還可以緩沖培養(yǎng)基的pH 值。由圖4可見，當磷酸二氫鉀濃度低時，隨著鹽濃度增加，肽得率增加，磷酸二氫鉀添加量為0.5%時，肽得率達到最大值11.17%，繼續(xù)增加磷酸二氫鉀的添加量，肽得率逐步下降，原因是高濃度磷酸鹽對微生物生長代謝產(chǎn)生抑制作用，因此，枯草芽孢桿菌發(fā)酵麥糟生產(chǎn)蛋白肽培養(yǎng)基的較佳磷酸二氫鉀添加量為0.5%。

2.2.5 pH值對肽得率的影響

在葡萄糖添加量5%，磷酸二氫鉀添加量0.5%，料液比1.0∶2.5（g∶mL）的條件下，拌料水不同pH值對枯草芽孢桿菌發(fā)酵麥糟生產(chǎn)蛋白肽的影響見圖5。

pH值大小不僅會影響微生物的生長代謝，也會影響蛋白酶及底物的解離狀態(tài)[23]，從而影響肽得率。由圖5可知，在pH5～9范圍內(nèi)，肽得率隨著pH值的增加呈先升后降趨勢，在配料水pH為7時，肽得率達到最大值。考慮到實際應用生產(chǎn)過程，中性pH對操作和設備的要求低，因此優(yōu)化試驗中拌料水選擇在pH=7條件下進行。

圖5 不同pH值對肽得率的影響Fig.5 Effect of different pH value on peptide yield

2.3 響應面法優(yōu)化培養(yǎng)基條件

在單因素試驗的基礎上，采用響應曲面法的Box-Behnken試驗方案優(yōu)化培養(yǎng)基條件，試驗設計及結果見表2。利用Minitab軟件對試驗數(shù)據(jù)進行分析，所得回歸方程系數(shù)顯著性檢驗結果見表3，模型的方差分析結果見表4。

表2 Box-Behnken試驗設計與結果Table2 Design and results of Box-Behnken experiments

表3 回歸系數(shù)顯著性分析Table3 Significance analysis of regression coefficients

表4 回歸模型方差分析Table4 Variance analysis of regression model

由表3可知，模型參數(shù)中，A、B、C、A2、B2、C2、AB、AC對肽得率影響極顯著（P＜0.01），BC對肽得率影響不顯著（P＞0.05）。自變量A、B、C對肽得率的影響大小為A＞B＞C，即葡萄糖添加量＞料液比＞磷酸二氫鉀添加量；各因素回歸擬合后得到回歸方程：

Y=12.26+0.776A+0.552B+0.349C-1.42A2-1.186B2-0.249C2+0.365AB-0.607AC+0.083BC

根據(jù)表4回歸模型方差分析結果，模型P＜0.01，表明該二次方程模型具有高度的顯著性；失擬項P＞0.05，表明模型失擬項不顯著；該模型決定系數(shù)R2=0.998 2，調整決定系數(shù)R2Adj=0.994 8，說明模型擬合度較好，預測值與試驗值具有高度相關性，可用該模型預測枯草桿菌發(fā)酵麥糟制備蛋白肽在不同條件下的肽得率。

根據(jù)回歸方程得出不同因子的響應面及等高線分析圖，結果見圖6。響應面及等高線圖可直觀反映各因素之間的交互作用對響應值影響程度，曲面越陡，等密度線越密，影響越顯著[24-26]。由圖6可知，因素A與因素B、因素A與因素C兩對交互作用響應圖陡峭，表明其對肽得率Y的影響極顯著（P＜0.01），而因素B與因素C的交互作用響應圖平坦，即其對肽得率Y的影響不顯著（P＞0.05）。

圖6 各因素交互作用對肽得率影響的響應面和等高線Fig.6 Response surface plots and contour lines of effects of interaction between each factor on the yield of peptide

經(jīng)過軟件分析優(yōu)化得到的條件為A=0.191 9，B=0.282 8，C=0.515 2，即葡萄糖添加量為4.192%、料液比為1∶2.141、磷酸二氫鉀添加量為0.603%，該條件下理論預測肽得率為12.504%。考慮到實際操作，將葡萄糖添加量調整為4.2%，料液比取1.0∶2.1（g∶mL），磷酸氫二鉀添加量取0.6%，此條件下重復3次試驗，取其平均值，肽得率實際值為12.40%，與預測值差別不大。

3 結論

采用枯草芽孢桿菌發(fā)酵生產(chǎn)麥糟蛋白肽過程中，確定了麥糟培養(yǎng)基中添加的最優(yōu)碳源為葡萄糖。試驗發(fā)現(xiàn)，葡萄糖添加量、料液比、磷酸二氫鉀添加量三因素及其二次項對肽得率影響極顯著，在交互作用關系中，葡萄糖添加量與料液比、葡萄糖添加量與磷酸二氫鉀添加量間交互作用對肽得率影響極顯著。在選擇的水平范圍內(nèi)，優(yōu)化得到的培養(yǎng)基條件是：pH7.0，葡萄糖添加量4.2%，料液比1.0∶2.1（g∶mL），磷酸氫二鉀添加量0.6%，該條件下肽得率達12.40%。本試驗利用微生物固態(tài)發(fā)酵麥糟制備蛋白肽方法可行，肽得率高，試驗結果可為麥糟蛋白肽的工業(yè)化生產(chǎn)提供理論依據(jù)，具有較好的應用價值。