美極梅奇酵母對遲采赤霞珠葡萄酒品質的影響

林雪青，張 翔，張 將，秦紹智，王世平，孫玉霞*

（1.山東省葡萄研究院 山東省葡萄栽培與精深加工工程技術研究中心，山東 濟南 250100；2.齊魯工業大學（山東省科學院），山東 濟南 250353；3.云南香格里拉太陽魂酒莊產業有限公司，云南 迪慶藏族自治州 674400；4.山東省農業科學院農產品研究所 山東省農產品精深加工技術重點實驗室 農業部新食品資源加工重點實驗室，山東 濟南 250100）

遲采葡萄酒是一種將延遲采收的葡萄，經過破碎壓榨發酵后而釀成的酒。遲采葡萄酒使用的葡萄因延遲采收過分成熟使含糖量很高，而這也導致遲采葡萄酒的揮發酸含量比正常葡萄酒含量高。非釀酒酵母是一類存在于葡萄園和葡萄表皮且參與葡萄酒釀造并對葡萄酒風味產生影響，除釀酒酵母外的其他酵母的總稱[1]。近年來研究發現，有些非釀酒酵母在與釀酒酵母混合發酵時能夠對葡萄酒產生積極影響，非釀酒酵母擁有比釀酒酵母更好的產酯能力[2]，可降低葡萄酒的乙醇含量[3]，在發酵過程中產生的糖苷酶[4]、果膠酶[5-6]和蛋白酶[7]等均多于釀酒酵母所產生的含量，這些發酵產物都對葡萄酒的香氣產生顯著影響。此外，TOFALO R等[8]研究發現，美極梅奇酵母在混合發酵時可以降低葡萄酒中揮發酸含量，增加其高級醇、酯和萜烯類物質的含量，同時會提升花香等香氣；VARELA C等[9]報道美極梅奇酵母屬酵母與釀酒酵母混合發酵可以降低成品酒中的揮發酸含量，并降低葡萄酒中的乙醇含量。雖然非釀酒酵母具有上述比釀酒酵母優良的性能，但是因其酒精和二氧化硫的耐受性較差，往往只在發酵前期發揮作用，葡萄酒的發酵主要依靠釀酒酵母對葡萄汁中糖類物質的轉化，在轉化過程中產生的眾多物質對葡萄酒的風味具有重要的影響。

香氣是葡萄酒品質的一個重要衡量指標，同時也是評價葡萄酒風味和典型性的重要因素[10]，酵母對葡萄酒揮發性香氣成分有著重要的影響。葡萄酒的香氣來源包括三類：品種香氣、發酵香氣及陳釀香氣[11]。品種香氣是葡萄品種獨特的香氣，不同的品種有著其獨特的品種香氣。有研究表明葡萄酒中的品種香氣受葡萄果實中降異戊二烯[12]以及萜烯類和芳香族類化合物的影響，而釀酒酵母細胞中β-葡萄糖苷酶的活性又與萜烯類化合物結合葡萄酒中的釋放有關，從而有助于增加葡萄酒的品種香氣[13]。釀酒酵母對葡萄酒發酵香氣也有著重要的作用，有研究表明酵母細胞會通過代謝氨基酸用于合成香氣物質[14]，此類香氣物質占葡萄酒香氣的比例最大。陳釀會增加葡萄酒的層次感，賦予葡萄酒更多的復雜風味，酵母自溶是產生葡萄酒陳釀香氣的重要過程[15]，在這一過程中細胞中的酯類、酮類、醛類物質得到釋放，增加了葡萄酒的香氣[16]。

本研究使用商業釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）CY3079與實驗室篩選的美極梅奇酵母（Metschnikowia pulcherrima）MP3007，以遲采赤霞珠葡萄為原料，通過分析浸漬發酵與清汁發酵后遲采葡萄酒中理化指標、揮發性香氣物質和感官品評風味品質的變化，探究美極梅奇酵母MP3007對遲采葡萄酒品質的影響，為美極梅奇酵母MP3007在遲采葡萄酒實際生產中的應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

赤霞珠葡萄：云南省德欽縣梅里酒莊葡萄園，單干雙臂，常規管理，2019年11月20日采收（通常本產區赤霞珠葡萄9月下旬采收）。可溶性固形物為33.9°Bx，pH為4.16，可滴定酸為4.77 g/L。

美極梅奇酵母（M.pulcherrima）MP3007：保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號CGMCC No.16078；釀酒酵母（S.cerevisiae）CY3079：上海杰兔工貿有限公司。

氫氧化鈉（分析純）：天津市風船化學試劑科技有限公司；氯化鈉（分析純）：國藥集團化學試劑有限公司；4-甲基-2-戊醇（色譜純）：美國Aldrich公司。

酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YEPD）固體培養基：葡萄糖2%，酵母浸粉1%，蛋白胨2%，瓊脂2%，氯霉素0.01%。121 ℃滅菌15 min。

1.2 儀器與設備

JA2003N電子天平：上海佑科儀器儀表有限公司；BX-1手持糖度計：日本京都電子公司；STAR A211pH計：賽默飛世爾科技公司；GC-7890B/MS-5977A氣相色譜-質譜聯用儀、DB-WAX 色譜柱：美國Agilent公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品處理

將美極梅奇酵母MP3007從YEPD固體培養基用接種環接種至YPD液體培養基中，于30 ℃、150 r/min擴培24 h，24 h后通過血球計數板計數方法[17]進行濃度確定。

處理一（清汁發酵）：將赤霞珠遲采葡萄手工破碎后，用8層紗布過濾處理，將得到的葡萄汁添加20 mg/L的偏重焦亞硫酸鉀，后將葡萄汁分裝于6個250 mL的錐形瓶，每瓶裝入200mL，編號CK-1，CK-2，CK-3，CF-1，CF-2和CF-3。其中CK的三組為對照組平均值，CF三組為實驗組平均值。

處理二（浸漬發酵）：將赤霞珠遲采葡萄手工破碎后的皮汁混合物添加20 mg/L的偏重焦亞硫酸鉀后分裝至6個250 mL的錐形瓶內，皮汁混合物質量與200 mL葡萄汁的質量相同，分別編號CK-1'，CK-2'，CK-3'，CF-1'，CF-2'和CF-3'。其中CK'的三組為對照組平均值，CF'三組為實驗組平均值。

處理一和處理二中的對照組接種菌株CY3079，接種量為1×106CFU/mL；處理一和處理二中的實驗組首先接種菌株MP3007，接種量為1×107CFU/mL，于48h后接種菌株CY3079，接種量為1×106CFU/mL。接種完成后使用單向排氣閥密封，于25 ℃培養箱中恒溫靜置發酵，直至發酵自然結束。

發酵過程中監測含糖量的變化，待含糖量穩定后取酒樣，于5 000×g，4 ℃離心2 min，取上清液于-20 ℃儲存待測。

1.3.2 分析檢測

（1）理化指標測定

遲采葡萄汁中的可滴定酸以及遲采葡萄酒酒樣中的殘糖、總酸、揮發酸、酒精含量按照葡萄酒國家標準GB/T 15038—2005《葡萄酒、果酒通用分析方法》中的相關檢測方法對進行檢測；遲采葡萄汁的初始含糖量使用手持折光計進行檢測；遲采葡萄汁和遲采葡萄酒酒樣的pH使用pH計檢測。

（2）揮發性物質測定

揮發性物質的檢測采用頂空固相微萃取-氣質聯用（headspace solid-phase micro extraction-gas chromatographymass spectrometry，HS-SPME-GC-MS）的方法[18]。運用美國國家標準技術研究所（national institute of standards and technology，NIST）11譜庫對檢測結果進行初步檢索分析，結合人工譜圖解析對化學成分定性；使用內標法對揮發性物質的含量定量。

（3）感官評定

對遲采葡萄酒的感官品評時，會將各葡萄酒樣品放于通風良好無任何氣味和噪音的房間，由經過專業培訓的品評人員采用定量分析描述法對各酒樣進行感官評價。品評小組成員先要各自對酒樣進行品評，記錄下可以反應當前酒樣特點的描述性詞匯，后經由品評組長總匯全部成員的全部描述性詞匯，經討論確定最終的描述性詞匯包括：花香味、果醬味、焦糖味、漿果味、生青味、香料味和典型性。

品評采用的標度一般為一條10 cm的直線，從左向右表示某種特征的強渡逐漸增強，由品評組成員在直線上標記特征的強烈程度，最后統計各成員對確定的7種描述性特征的標記，轉化為數值輸入電腦進行統計分析。

1.3.3 數據處理

采用SPSS 21軟件進行數據分析，采用方差分析One-Way（P＜0.05）法進行多組間比較。采用SPSS 21.0軟件進行主成分分析繪制得分圖和載荷圖。

2 結果與分析

2.1 美極梅奇酵母對遲采葡萄酒理化指標的影響

采用美極梅奇酵母與釀酒酵母混合發酵的遲采葡萄酒和釀酒酵母純種接種發酵的遲采葡萄酒的主要理化指標檢測結果如表1所示。

表1 遲采葡萄酒對照組和實驗組的理化指標Table1 Physical and chemical indexes of control group and experimental group of late-harvested grape wine

從表1可以看出，無論是浸漬發酵還是清汁發酵，菌株MP3007參與的實驗組揮發酸、總酸和最終的酒精含量均顯著低于對照組（P＜0.05）。其中菌株MP3007參與的實驗組在清汁發酵時揮發酸比對照組降低了31.7%，總酸含量降低了10.8%，酒精度降低了4.1%；在浸漬發酵時揮發酸比對照組降低了25.6%，總酸含量降低了23.4%，酒精度降低了5.1%。菌株MP3007與菌株CY3079混合發酵降低揮發酸含量效果明顯。由于兩種酵母的酒精產率不同，菌株MP3007比菌株CY3079的酒精產率低，混合發酵時優先接入菌株MP3007，菌株MP3007會將葡萄糖轉化為酒精和其他副產物，而菌株CY3079純發酵的對照組則會產生更多的酒精。另有研究表明，皮渣加入發酵體系中會降低發酵體系中總糖的含量[19]，總糖含量的降低導致了酒精度的降低，因此相比于清汁發酵，浸漬發酵組的酒精含量展現出較低的水平。

2.2 美極梅奇酵母對遲采葡萄酒香氣成分的影響

2.2.1 酯類物質

遲采葡萄酒對照組和實驗組酒樣GC-MS檢測結果中酯類物質的含量見表2。

表2 遲采葡萄酒中酯類物質含量Table2 Contents of esters in late-harvested grape wine

從表2可知，混合發酵顯著提高了乙酸異戊酯、己酸乙酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯的含量，其中增加比例最明顯的為乙酸異戊酯，其次是己酸乙酯、癸酸乙酯。與對照組相比，混合發酵清汁時乙酸異戊酯的含量增加了54.7%，浸漬發酵時增加了32.3%，正己酸乙酯的含量在混合發酵清汁時增加了40.4%，浸漬發酵時增加了18.9%，癸酸乙酯的含量在混合發酵清汁時則增加了32.8%，浸漬發酵時增加了21.1%。此外表2揭示了浸漬發酵和混合發酵均可提高表中酯類物質的總含量。表2中丁酸乙酯、己酸乙酯、辛酸乙酯和癸酸乙酯的氣味活度值（odor activity value，OAV）均＞10，此4種物質對遲采葡萄酒果香的貢獻度突出；乙酸苯乙酯和月桂酸乙酯的OAV＞1，二者對遲采葡萄酒花香有較大貢獻度。以上物質是賦予葡萄酒花香味和果香味的重要物質，對改善葡萄酒香氣具有積極作用。

由圖1可知，共有5種OAV＞1的酯類物質分布在第一象限和第四象限，占酯類物質種類的62.5%，這表明與清汁發酵相比，浸漬發酵能夠產生更多種類的酯類物質，增加遲采葡萄酒香氣的復雜程度。

圖1 酒樣中OAV＞1的化合物在PC1和PC2上的載荷圖（a）和主成分分析得分圖（b）Fig.1 Loading plot (a) and principal component analysis score graph(b) of aroma compounds (OAV＞1) on PC1 and PC2 of wine samples

在浸漬發酵情況下，混合發酵會進一步提高酯類物質的總含量。暗示菌株MP3007可以利用葡萄皮浸漬出的物質合成酯類物質。發酵體系中的可同化氮源是酵母合成香氣類物質的前體物質[20]，浸漬可能使發酵體系中含有較多的可同化氮，在發酵過程中被MP3007酵母細胞轉化為酯類物質，VARELA C等[21]研究表明，美極梅奇酵母與釀酒酵母混合發酵能夠提高酯類物質的含量，此實驗結果證明美極梅奇酵母MP3007同樣具有在混合發酵時增加酯類物質含量的能力。

2.2.2 醇類物質

遲采葡萄酒對照組和實驗組酒樣GC-MS檢測結果中醇類物質的含量見表3。葡萄酒中的高級醇是葡萄酒香氣的重要組成成分，有研究發現當葡萄酒中的高級醇含量低于300 mg/L時，可以提高葡萄酒風味的復雜性[22]。從表3可以看出，各實驗組醇類物質總含量均低于300 mg/L，其中CK組的醇類物質總量最高，為126.26 mg/L，CK'組的醇類物質總量最低，為87.30 mg/L。混合發酵對某些醇類物質的含量有明顯影響，如顯著降低異丁醇、正己醇、苯乙醇含量，顯著提高異戊醇的含量（P＜0.05）。與對照組相比，清汁發酵時1-己醇含量降低了5.4%，苯乙醇含量降低了39.1%，異丁醇含量降低了16.7%，異戊醇含量升高了9.2%；浸漬發酵時正己醇含量降低了45.7%，苯乙醇含量降低了14.2%，異丁醇含量降低了20.8%，異戊醇含量提高了50.6%。除上述醇類物質外，2,3-丁二醇在浸漬發酵與清汁發酵組合中的含量變化不同。在清汁發酵時混合發酵組合比對照組2,3-丁二醇含量升高了63.0%，但是在浸漬發酵時混合發酵組與對照組的2,3-丁二醇含量沒有明顯差異（P＞0.05）。表3中顯示OAV＞1的醇類物質為異戊醇、1-辛醇和苯乙醇，表明此3種醇類物質對遲采葡萄酒的香氣貢獻度較大。

表3 遲采葡萄酒中醇類物質含量Table3 Content of alcohols in late-harvested grape wine

有研究表明，葡萄酒中的醇類物質來源于發酵以及酵母對氨基酸的轉化[23]。清汁發酵時，混合發酵組的醇類物質總含量比對照組降低了17.7%；但是浸漬發酵時，混合發酵組的醇類物質總含量比對照組升高了22.9%。試驗中，異戊醇含量在檢測出的醇類物質中占據主要地位，其含量占醇類物質總含量的43.3%～69.1%，混合發酵顯著降低了其他醇類物質的含量，卻顯著提高了異戊醇的含量，尤其是在浸漬發酵時，提升幅度很大。發酵過程中異戊醇的合成前體氨基酸為亮氨酸[24]，實驗結果表明菌株MP3007可能具有較強的亮氨酸轉化能力。

2.2.3 醛酸類、酮類和萜烯類物質

遲采葡萄酒對照組和實驗組酒樣GC-MS檢測結果中醛酸類、酮類和萜烯類物質的含量見表4。從表4可以看出，清汁發酵時與對照組相比，混合發酵能夠降低33.6%的辛酸含量，在浸漬發酵時辛酸含量降低了28.8%，并且浸漬發酵時無論對照組還是混合發酵組，辛酸含量均明顯低于清汁發酵的對照組和混合發酵組。辛酸是一種具有腐臭味的物質，對葡萄酒風味具有不利的影響，表4中顯示辛酸的OAV在CK組中最高（2.14），而在CF'組中最低（0.94），暗示了浸漬發酵和混合發酵可削弱辛酸給葡萄酒帶來的不良風味。己酸是一種具有奶酪味的物質，混合發酵能夠顯著提高己酸的含量（P＜0.05），在清汁發酵時其含量提高了34.6%，浸漬發酵時其含量提高了1.75倍。

萜烯類化合物的閾值較低，是葡萄酒中花香味和果香味的重要組成部分[25]，萜烯類物質的含量與酵母菌株種類以及接種方式有很大關系[26]。從表4可知，浸漬發酵時混合發酵比對照降低了17.8%苯乙烯含量，但清汁發酵時二者無明顯差異。香茅醇能夠賦予葡萄酒玫瑰花香風味，混合發酵顯著提高了香茅醇的含量，清汁發酵時含量提高了33.3%，浸漬發酵時含量提高了77.8%。大馬士酮具有蜂蜜味、甜果香[27]，但僅在清汁發酵時檢測出，浸漬發酵時并未檢測到，其含量在混合發酵組中顯著提高，比CK組提高了2倍，其OAV在CF組中較大（5400），表明混合發酵可賦予遲采葡萄酒更明顯的花香風味。

表4 遲采葡萄酒中醛酸類和萜烯類物質含量Table4 Content of aldehydic acids and terpenes in late-harvested grape wine

2.3 美極梅奇酵母對遲采葡萄酒感官品質的影響

從圖2可以看出，與對照組相比，混合發酵組的遲采葡萄酒感官品質更突出，表現為明顯的花香味和果香味，其生青味比對照組弱，這一現象與酯類物質含量以及OAV的結果一致。丁酸乙酯、己酸乙酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯、乙酸苯乙酯和月桂酸乙酯對葡萄酒的花香和果香貢獻程度很大，表2中顯示上述酯類物質在混合發酵組中均得到了提高，尤其是在浸漬發酵時，上述酯類物質的含量提升更加顯著，且OAV均＞1；異丁醇是賦予葡萄酒生青味的重要物質，表3顯示混合發酵使異丁醇含量顯著降低。另外，圖2顯示浸漬發酵時混合發酵組在花香味、漿果味、典型性方面比清汁發酵時混合發酵組表現突出，而后者則在香料味、焦糖味、果醬味方面表現突出。綜上所述，菌株MP3007在降低遲采葡萄酒生青味，增加花香味和果香味，提高復雜性方面展現了優點，在遲采葡萄酒釀造領域具有應用潛力。

圖2 遲采葡萄酒對照組和實驗組感官評價結果Fig.2 Sensory evaluation results of control group and experimental group of late-harvested grape wine

3 結論

赤霞珠遲采葡萄經不同處理發酵后的葡萄酒差異明顯。與對照組相比，混合發酵清汁時可以降低葡萄酒中31.7%的揮發酸含量，14.5%的總酸含量以及4.1%的酒精含量；混合浸漬發酵時可以降低葡萄酒中25.6%的揮發酸含量，8.4%的總酸含量以及5.1%的酒精含量。同時，混合發酵還會增加葡萄酒中乙酸異戊酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯等酯類物質的含量；混合發酵對某些醇類物質的含量也存在影響，可以增加異戊醇、2,3-丁二醇和異丁醇的含量而降低1-己醇、1-辛醇和苯乙醇的含量；另外，與對照組相比混合發酵可以賦予葡萄酒更多的花香味、果醬味和焦糖味，降低葡萄酒的生青味。浸漬發酵比清汁發酵會產生更多種類的酯類物質，并且顯著提高了酯類物質的總含量，賦予葡萄酒更明顯的花香味和漿果味。初步認為美極梅奇酵母菌株MP3007在遲采葡萄酒釀造領域具有應用潛力。