不同砧木對(duì)赤霞珠干紅葡萄酒花色苷及其抗氧化活性的影響

鄭秋玲，譚玉超，肖慧琳，賀長(zhǎng)映，劉萬好，王建萍，劉笑宏，唐美玲，杜遠(yuǎn)鵬，宮 磊，宋志忠，盧建聲*，徐維華

（1.山東省煙臺(tái)市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，山東 煙臺(tái) 265500；2.煙臺(tái)張?jiān)？ㄋ固鼐魄f有限公司，山東 煙臺(tái) 265500；3.牟平區(qū)果樹技術(shù)推廣中心，山東 煙臺(tái) 264100；4.山東農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝科學(xué)與工程學(xué)院，山東 泰安 271018；5.山東省葡萄研究院，山東 濟(jì)南 250100；6.魯東大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，山東 煙臺(tái) 264025）

葡萄產(chǎn)業(yè)是山東省特色優(yōu)勢(shì)產(chǎn)業(yè)，截至2016年，葡萄栽培面積達(dá)4.33萬hm2，其中釀酒葡萄為1.94萬hm2，約占全國(guó)的35%[1]。膠東半島位于山東省東端，屬暖溫帶濕潤(rùn)季風(fēng)氣候，光照充足、降水充沛、溫差適宜，利于釀酒葡萄的生長(zhǎng)，為山東葡萄的優(yōu)勢(shì)產(chǎn)區(qū)。但是隨著全球氣候變化，近幾年，山東產(chǎn)區(qū)釀酒葡萄遭受極端低溫、干旱、鹽堿化等不利條件的危害，影響著葡萄產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。研究表明，砧木和接穗互作，不僅提高葡萄對(duì)鹽堿、干旱、凍害的抗逆性[2-5]，還可以影響地上部接穗的生長(zhǎng)[6-7]、礦質(zhì)元素的吸收[8-9]以及果實(shí)品質(zhì)[10-12]的改變。因此，推廣嫁接栽培仍然是我國(guó)葡萄產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展的首要任務(wù)[13]。

赤霞珠（Cabernet Sauvignon，CS）葡萄是世界第二大品種，幾乎遍布所有的葡萄種植園，用其釀造的葡萄酒具有典型的紫羅蘭和甜椒香味，深受各國(guó)人民喜愛[14]。前人對(duì)赤霞珠砧穗組合研究較早，但大多集中于砧木對(duì)赤霞珠植株的抗逆性[5，15-16]、生長(zhǎng)發(fā)育及果實(shí)品質(zhì)[17]的影響，關(guān)于砧木對(duì)葡萄酒的影響報(bào)道較少；因此，本研究以4種赤霞珠砧穗組合所釀葡萄酒為試材，研究不同砧木對(duì)赤霞珠葡萄酒花色苷單體成分及含量、次生代謝物質(zhì)以及抗氧化性活性的影響，以期為膠東產(chǎn)區(qū)赤霞珠砧穗組合篩選提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

赤霞珠（CS）與4種砧木（Beta、Ru、1103P、5BB）不同砧穗組合的葡萄酒（分別記作CS/Beta、CS/140Ru、CS/1103P、CS/5BB）：釀酒果實(shí)均取自標(biāo)準(zhǔn)化管理基地，山東省煙臺(tái)市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院蓬萊試驗(yàn)示范基地。

2,2-聯(lián)氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽（2,2'-azinobis-（3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate，ABTS）、福林酚試劑、1,1-二苯基-2-苦肼基（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）（均為分析純）：美國(guó)Sigma公司；花青素-3-O-葡萄糖苷（cyanidin-3-O-glucoside，Cy）（純度≥98%）：蘇州科銘生物技術(shù)有限公司；商業(yè)釀酒酵母CECA：上海鼎唐國(guó)際貿(mào)易有限公司；其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

PHS-3C pH計(jì)：上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；L3S可見分光光度計(jì)：上海儀電分析儀器有限公司；GL-20G-Ⅱ離心機(jī)：中國(guó)安科公司；Agilent 1260 Infinity高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）儀：美國(guó)安捷倫科技有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 葡萄酒釀造工藝

采集4個(gè)砧穗組合的葡萄果實(shí)，成熟后破碎入5 L小罐，按照60 mg/L的量加入SO2；加入酵母，進(jìn)行主發(fā)酵－酒精發(fā)酵過程，發(fā)酵溫度控制在25 ℃，發(fā)酵時(shí)間6 d，殘?zhí)墙抵? g/L，主發(fā)酵結(jié)束，然后進(jìn)行皮渣分離，分離后進(jìn)行后發(fā)酵，后發(fā)酵結(jié)束后，終止發(fā)酵；進(jìn)入葡萄酒的陳釀，保持溫度20～25 ℃，陳釀2個(gè)月后，澄清與過濾后，用于葡萄酒次生代謝物質(zhì)分析、花色苷單體及抗氧化活性測(cè)定，所有指標(biāo)平行測(cè)定3次。

1.3.2 色度測(cè)定方法

酒樣經(jīng)0.45 μm濾膜過濾，用相同pH的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液稀釋10倍于1 cm比色皿中，測(cè)定波長(zhǎng)420 nm、520 nm、620 nm處的吸光度值，色調(diào)及色度計(jì)算公式：

1.3.3 葡萄酒花色苷單體的測(cè)定

每份葡萄酒取樣200 mL，經(jīng)0.2 μm濾膜過濾后采用高效液相色譜儀進(jìn)行檢測(cè)。色譜條件：Kromasil C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動(dòng)相A為甲酸∶水=1∶9（V/V），流動(dòng)相B為甲酸∶乙腈=1∶9（V/V）；洗脫程序：0～1min，3%B；1～12 min，3%～15%B；12～14 min，15%～25%B；14～28min，25%～30%B；28～32 min，30%～4%B；32～40 min，4% B；流速1 mL/min，柱溫30 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)525 nm，進(jìn)樣量20 μL。

花色苷定性工作基于已有文獻(xiàn)中的紫外光譜圖和保留時(shí)間等信息的比對(duì)分析。物質(zhì)結(jié)構(gòu)的鑒定參考標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)及梁振昌[18]的方法。定量分析：建立10～200 mg/L 5個(gè)水平的花青素-3-O-葡萄糖苷標(biāo)準(zhǔn)曲線，R2=0.999 2，其他花色苷以相當(dāng)于花青素-3-O-葡萄糖苷含量計(jì)。

1.3.4 葡萄酒次生代謝物質(zhì)測(cè)定

采用Folin-Ciocalteu法[19]測(cè)定總酚含量；亞硝酸鹽-氯化鋁法[20]測(cè)定類黃酮含量；pH示差法[21]測(cè)定花色苷含量；Folir-Denis[22]法測(cè)定單寧含量，以單寧酸計(jì)。

1.3.5 體外抗氧化活性測(cè)定

DPPH自由基（DPPH·）清除率、ABTS自由基（ABTS+·）清除率參考楊延峰等[23]的方法、鐵離子還原能力（ferric ion reducing antioxidant power，F(xiàn)RAP）測(cè)定參考陳純[24]的方法。

1.3.6 數(shù)據(jù)分析方法

數(shù)據(jù)整理及作圖均采用Excel 2010，顯著性分析采用DPS 7.05中Duncan's比較方法，P＜0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同砧木對(duì)赤霞珠干紅葡萄酒色度、色調(diào)的影響

葡萄酒的色度反映了其顏色的深淺；具備高色度葡萄酒，呈現(xiàn)結(jié)構(gòu)感強(qiáng)、醇厚、豐滿、味澀以及單寧感強(qiáng)的口感特征；在新釀制的干紅葡萄酒中色度越大，酒體的顏色越好。

由圖1可知，CS/Beta、CS/1103P、CS/5BB葡萄酒色度無顯著差異性（P＞0.05），分別比CS/140Ru顯著提高84.17%、69.50%、52.12%。葡萄酒的色調(diào)反映的是其顏色的種類，與其種類、成熟度和酒齡密切相關(guān)，色調(diào)越高，葡萄酒顏色的黃色比例越大，反之紅色比例越大。4種葡萄酒的色調(diào)無顯著差異（P＞0.05）。

圖1 不同砧穗組合赤霞珠葡萄酒色度色調(diào)對(duì)比Fig.1 Comparison of chroma and hue of Cabernet Sauvignon wines with different rootstock-scion combinations

2.2 不同砧木對(duì)赤霞珠干紅葡萄酒花色苷單體組分及含量的影響

不同砧穗組合赤霞珠所釀葡萄酒花色苷單體組分及含量見表1。

表1 不同砧穗組合赤霞珠葡萄酒中的花色苷單體組分及含量對(duì)比Table1 Comparison of anthocyanin monomer components and contents in of Cabernet Sauvignon wines with different rootstock-scion combinations

由表1可知，從花色苷單體組分來看，CS/Beta葡萄酒檢測(cè)到的花色苷單體種類最多，為8種，CS/5BB、CS/1103P葡萄酒均檢測(cè)到7種，而CS/140Ru葡萄酒只檢測(cè)到4種主要花色苷，在所有組合中種類最低；不同葡萄酒的主要花色苷也不盡相同，CS/Beta葡萄酒以香豆酰化花色苷為主，CS/5BB葡萄酒、CS/1103P葡萄酒以乙酰化花色苷為主，花色苷單體種類最少的CS/140Ru葡萄酒則以基本花色苷為主；4種葡萄酒均僅檢測(cè)到2種基本花色苷。

從花色苷單體含量來看，基本花色苷中，二甲花翠素3-O-葡萄糖苷含量以CS/Beta葡萄酒的最高，CS/140Ru次之，CS/Beta的含量比CS/5BB、CS/1103P顯著提56.49%、83.41%，CS/140Ru的含量比CS/5BB、CS/1103P顯著提高44.15%、68.94%；甲基花翠素葡萄糖苷含量以CS/140Ru葡萄酒最高，分別是CS/5BB、CS/Beta、CS/1103P的5.01倍、3.40倍、1.47倍；乙酰化花色苷中，甲基花翠素3-O-（6-O-乙酰化）葡萄糖苷和二甲花翠素3-O-（6-O-乙酰化）葡萄糖苷含量均以CS/5BB葡萄酒最高，其中，甲基花翠素3-O-（6-O-乙酰化）葡萄糖苷含量分別比CS/Beta、CS/1103P顯著增加28.30%、44.74%，二甲花翠素3-O-（6-O-乙酰化）葡萄糖苷含量比CS/1103P顯著增加35.99%，甚至達(dá)CS/Beta葡萄酒的5.36倍；花翠素3-O-（6-O-乙酰化）葡萄糖苷含量以CS/Beta葡萄酒最高，分別比CS/5BB、CS/1103P、CS/140Ru顯著增加45.34%、73.24%、16.36%；香豆酰化花色苷中，花青素3-O-（6-O-香豆酰化）葡萄糖苷以CS/5BB含量最高，分別比CS/Beta、CS/1103P顯著增加56.65%、27.25%，甲基花青素3-O-（6-O-香豆酰化）葡萄糖苷、二甲花翠素3-O-（6-O-香豆酰化）葡萄糖苷均以CS/Beta含量最高。從花色苷單體總量來看，CS/Beta含量分別比CS/5BB、CS/1103P、CS/140Ru提高23.11%、31.76%、53.13%。

2.3 不同砧木對(duì)赤霞珠干紅葡萄酒次生代謝物質(zhì)含量的影響

由圖2可知，CS/Beta葡萄酒中的總酚、類黃酮、花色苷、單寧含量在所測(cè)組合中含量最高，CS/5BB次之，但二者的總酚與花色苷含量無顯著性差異。

圖2 不同砧穗組合赤霞珠葡萄酒中次生代謝物質(zhì)含量對(duì)比Fig.2 Comparison of secondary metabolites contents in Cabernet Sauvignon wines with different rootstock-scion combinations

CS/Beta葡萄酒總酚含量分別比CS/1103P、CS/140Ru顯著提高22.70%、71.56%，類黃酮含量分別比CS/5BB、CS/1103P、CS/140Ru顯著提高1.00%、3.55%、6.78%，單寧含量分別比CS/5BB、CS/1103P、CS/140Ru顯著提高12.18%、44.77%、102.20%；花色苷含量分別比CS/1103P、CS/140Ru顯著提高40.71%、154.53%；CS/5BB葡萄酒的總酚含量分別比CS/1103P、CS/140Ru顯著提高17.24%、63.94%，類黃酮含量分別比CS/1103P、CS/140Ru顯著提高2.53%、5.73%，單寧含量分別比CS/1103P、CS/140Ru顯著提高29.06%、80.26%；花色苷含量分別比CS/1103P、CS/140Ru組合顯著提高與34.93%、144.07%。

2.4 不同砧木對(duì)赤霞珠干紅葡萄酒抗氧化活性的影響

不同砧穗組合赤霞珠葡萄酒抗氧化活性對(duì)比見圖3。由圖3可知，4種葡萄酒的DPPH·清除率、ABTS+·清除率、FRAP值均以CS/Beta葡萄酒最高，CS/5BB葡萄酒次之。

圖3 不同砧穗組合赤霞珠葡萄酒抗氧化活性對(duì)比Fig.3 Comparison of antioxidant activity of Cabernet Sauvignon wines with different rootstock-scion combinations

經(jīng)計(jì)算可得，CS/Beta、CS/5BB葡萄酒的DPPH·清除率分別比CS/1103P顯著提高14.09%、8.89%，比CS/140Ru顯著提高10.02%、5.01%（P＜0.05）；CS/Beta、CS/5BB、CS/140Ru葡萄酒的ABTS+·清除率分別比CS/1103P顯著提高17.89%、17.54%、16.95%（P＜0.05），CS/Beta葡萄酒的FRAP值分別比CS/1103P、CS/140Ru顯著提高40.75%、26.87%（P＜0.05）。

2.5 討論

花色苷是葡萄酒中的關(guān)鍵呈色物質(zhì)[25]。本研究表明，砧穗組合影響葡萄酒中的花色單體組分和含量，試驗(yàn)處理中，CS/Beta葡萄酒以香豆酰化花色苷為主，CS/5BB、CS/1103P葡萄酒以乙酰化花色苷為主，CS/140Ru葡萄酒則以基本花色苷為主，而色調(diào)色度測(cè)定顯示，CS/140Ru色度偏低，與其花色苷單體組分和含量均較為單一相一致，這可能是由于葡萄酒釀造過程中，酒精發(fā)酵和蘋果酸乳酸發(fā)酵過程中花色苷單體含量會(huì)不同程度轉(zhuǎn)化[26]，最終造成花色苷單體含量的變化；也有可能是受貯藏階段溫度、微氧等環(huán)境條件對(duì)花色苷轉(zhuǎn)化的影響[26]，還有可能是砧穗組合直接影響葡萄果實(shí)花色苷單體組分與含量，釀造后間接影響葡萄酒花色苷的組分與含量。

酚類物質(zhì)影響葡萄酒的氣味、顏色、口感等形態(tài)學(xué)指標(biāo)，并具有抗氧化功能[27]，是植物重要的次生代謝物質(zhì)，也是葡萄酒的品質(zhì)貢獻(xiàn)及功能性物質(zhì)。葡萄酒中的酚類物質(zhì)一方面來自發(fā)酵過程中的皮渣浸提[28]，另一方面來自發(fā)酵過程中微生物代謝[29]。本試驗(yàn)研究表明，砧木Beta、5BB顯著增加了葡萄酒中的總酚、類黃酮、花色苷、單寧的含量，改善了葡萄酒的色度，增強(qiáng)了葡萄酒的抗氧化活性，即砧木影響葡萄酒酚類物質(zhì)含量，根據(jù)試驗(yàn)設(shè)計(jì)的唯一差異原則，果實(shí)中次生代謝物質(zhì)的差異源自砧木差異，因此，本試驗(yàn)從一定程度上說明并側(cè)面驗(yàn)證了砧木影響葡萄果實(shí)次生代謝產(chǎn)物，這與前人研究結(jié)果一致[17，30，11]。

3 結(jié)論

試驗(yàn)以4種砧穗組合（CS/Beta、CS/140Ru、CS/1103P、CS/5BB）所產(chǎn)果實(shí)釀造的葡萄酒為試材，通過測(cè)定不同砧穗組合下赤霞珠葡萄酒的花色苷單體組分與含量、其他次生代謝物質(zhì)含量及葡萄酒抗氧化活性。結(jié)果顯示砧木可以改變赤霞珠葡萄酒花色苷單體組分與含量，CS/Beta單體組分最多（8種），且其香豆酰化比例較高，CS/5BB次之（7種），酰化比例較高；砧木Beta對(duì)提升赤霞珠葡萄酒的總酚、類黃酮、花色苷、單寧指標(biāo)作用顯著，CS/5BB次之；色度方面，CS/Beta、CS/1103P、CS/5BB優(yōu)于組合CS/140Ru；抗氧化活性方面，組合CS/Beta、CS/5BB還原力均顯著高于組合CS/1103P、CS/140Ru（P＜0.05）。綜合看，砧木Beta、5BB對(duì)于改善赤霞珠葡萄干紅葡萄酒品質(zhì)方面有重要作用，可考慮作為赤霞珠嫁接苗的首選砧木。