不同釀酒酵母對白蘭地香氣的影響研究

劉曉露，李記明，阮仕立，王根杰，張葆春，畢蕓杰，姚圣圣，張舒凡，馮 磊，趙玉平*

（1.煙臺大學 生命科學學院，山東 煙臺 264003；2.煙臺張裕集團有限公司 山東省葡萄酒微生物發酵技術重點實驗室，山東 煙臺 264001）

白蘭地通常是以葡萄為原料，經過發酵、蒸餾、貯藏以及陳釀而成[1-2]。其香氣成分非常復雜，其來源主要來源于以下三個方面[3-5]：品種、發酵過程及陳釀過程。香氣是衡量白蘭地感官品質的重要組成部分。香氣成分的種類及其含量是評價白蘭地品質高低的一個重要指標[6]。不同品種釀制的白蘭地香氣成分千差萬別，相同品種釀制而成的白蘭地香氣成分也會受到釀酒原料、栽培條件、發酵工藝、蒸餾工藝以及橡木桶陳釀等多種因素的影響[7]。目前，關于白蘭地香氣成分的研究較多[8-10]。如程顯好等[11]研究不同酵母菌對白蘭地揮發性成分的影響，通過測定葡萄汁發酵前后以及葡萄酒蒸餾前后成分的差異，檢測到35種揮發性成分，發現不同酵母會影響白蘭地的揮發性成分。姜忠軍[12]研究不同的釀酒品種及釀酒酵母對發酵過程中的有機酸、pH、香氣成分的影響，發現不同酵母對白蘭地香氣和感官有不同的影響。白玉霓作為釀造白蘭地的優良葡萄品種，在煙臺地區大面積種植。本研究采用頂空固相微萃取-氣質聯用（headspace solid phase microextraction-gas chromatographymass spectrometry,HS-SPME/GC-MS）對3種不同釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）的白玉霓白蘭地揮發性成分進行分析，比較3種不同釀酒對白蘭地揮發性成分的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

白玉霓葡萄、釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）D254、QA23、FC9：煙臺張裕集團有限公司。

NaCl（分析純）：國藥集團化學試劑有限公司；3-辛醇（分析純）：美國Sigma公司。

1.2 儀器與設備

QP2010SE氣相色譜-質譜聯用（GC-MS）儀：日本島津公司；DB-Wax型色譜柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）：美國Agilent公司；57328-U萃取頭（50/30 μm DVB/CAR/PSMS）：美國Supelco公司；固相微萃?。╯olid phase micro-extraction，SPME）手動進樣手柄：美國Supelco公司；DF-101SZ恒溫加熱磁力攪拌器：鞏義市科瑞儀器有限公司；XLD夏朗德蒸餾器：山東盛泉泵業有限公司。

1.3 方法

1.3.1 白蘭地的制備

葡萄原料的處理：對白玉霓葡萄進行除梗、破碎、壓榨，取葡萄汁（糖度為138 g/L）分別放入3個20 L的玻璃罐中。葡萄處理過程中添加適量干冰降溫以減少氧化，且不添加SO2。

酵母活化：將一定量酵母放入燒杯中，加入10倍酵母質量的37 ℃去離子水，放入37 ℃的恒溫水浴鍋中活化15 min，在逐步加入少量的葡萄汁，酵母活化液降至溫度與葡萄汁溫差在10 ℃以內。酵母接種量為0.2 g/L。

原酒發酵：18～20 ℃控溫發酵，發酵過程中每隔12 h監測發酵液的溫度和比重。待發酵液的比重＜0.995、殘糖≤2 g/L，發酵結束。進行澄清倒罐，得到原汁白蘭地原酒。

蒸餾：采用夏朗德壺式蒸餾鍋進行二次蒸餾。第一次蒸餾待餾出液酒精度降至1%vol以下時，得到粗餾白蘭地，蒸餾酒精度大約28%vol～30%vol左右。將粗餾原白蘭地進行二次蒸餾，去酒頭（約占酒精總含量的1%），待餾出液酒精度降至55%vol以下時停止蒸餾，獲得的酒身即為原白蘭地，酒精度68%vol～70%vol左右。

1.3.2 HS-SPME/GC-MS分析

HS-SPME進行預處理：取待測樣品，用蒸餾水或乙醇將樣品乙醇含量稀釋至10%vol。準確量取5 mL 10%vol的白蘭地樣品稀釋液于20 mL萃取瓶中，加入2.0 g NaCl，再加入3-辛醇（質量濃度為0.818 g/mL）作為內標物。將待測樣品瓶放入帶有磁力攪拌的50 ℃恒溫水浴鍋中，調整轉速為500 r/min，預平衡10 min，將萃取頭插入萃取瓶中，萃取30 min。萃取結束后，并迅速插入氣相色譜的進樣口中，解吸5 min。

GC條件：進樣器溫度250 ℃，色譜柱為DB-Wax型色譜柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；檢測器溫度為220 ℃，載氣為高純氦氣（He），流速為2 mL/min。分流進樣，分流比為1∶5。程序升溫條件：初始溫度40 ℃，保持2 min，6 ℃/min升溫至100 ℃，5 ℃/min升溫至200 ℃，保持10 min，溶劑不延遲。

MS條件：采用電子電離（electronic ionization，EI）源，電子能量70 eV，離子源溫度200 ℃，接口溫度240 ℃，掃描方式為全掃描，掃描范圍為30.00～500.00 amu。

定性分析：將GC-MS檢測的未知化合物的圖譜與美國國家標準與技術研究院（national insititute of standards and technology，NIST）譜庫II并結合文獻報道的保留指數（retention index，RI）進行比對定性。

定量分析：采用3-辛醇作為內標，進行半定量法分析。按照如下公式計算各組分含量：

1.3.3 統計分析

采用Microsoft Office Excel 2010和SPSS25.0軟件單因素方差分析（analysis of variance，ANOVA）對數據進行處理和分析。利用Origin 8.5軟件進行主成分分析。

2 結果與分析

2.1 不同酵母白蘭地揮發性成分分析

采用酵母D254、QA23、FC9發酵、蒸餾得到的白蘭地樣品依次編號為D、Q、F。利用GC-MS測定3種白蘭地的揮發性成分，結果見表1。

表1 不同酵母釀造白蘭地中揮發性成分GC-MS分析結果Table1 Results of volatile components in Brandy brewed by different yeasts analysis by GC-MS

續表

由表1可知，總共檢測到69種主要成分，其中酯類29種、醇類13種、萜烯類8種、縮醛類7種、醛酮類5種、芳香類4種、有機酸類2種以及其他類1種。酯類和醇類物質是揮發性成分中主要的物質，占總揮發性化合物總量的60%以上。

酯類物質是白蘭地揮發性成分種含量最豐富的物質，是由酸類物質和醇類物質在蒸餾過程中通過一系列的酯化反應生成的[13]。D白蘭地中檢測到16種酯類物質，總酯總量為804.58 mg/L；Q白蘭地中檢測到26種酯類物質，總酯含量為2 751.00 mg/L；F白蘭地中檢測到26種酯類物質，總酯含量為2 614.44 mg/L。3種白蘭地中含量最多的酯類分別為壬酸乙酯、月桂酸乙酯、辛酸乙酯、9-癸烯酸乙酯、己酸乙酯，同時這5種物質也是白蘭地中骨架香氣中比較重要的幾種酯類物質。除辛酸乙酯，其余4種酯類物質含量，D與Q、F白蘭地有顯著差異性（P＜0.05）。乙酸異丁酯、辛酸丙酯、丁酸乙酯這3種酯類物質含量在Q和F白蘭地中比較豐富，但在D白蘭地中未檢測到。壬酸乙酯是3種白蘭地中含量最高的酯類物質，也是白蘭地的骨架香氣之一[9]。壬酸乙酯具有水果味，芳香帶甜，有脂肪臭[14]。

醇類一般是葡萄原料在發酵的過程中，通過酵母的發酵代謝使發酵汁中的糖轉化為醇，然后通過蒸餾過程，進入到原白蘭地中。D、Q、F白蘭地均檢測到10種醇類物質，總醇含量依次為472.4 mg/L、791.50 mg/L、718.99 mg/L。在3種白蘭地中，共有7種醇類物質：1-丙醇、2-甲基丙醇、1-丁醇、4-甲基-1戊醇、3-甲基-1-戊醇、正己醇、正辛醇。在共有7種醇類物質中，去除1-丁醇、4-甲基-1戊醇和3-甲基-1-戊醇這3種醇類物質，其余4種醇類在不同的白蘭地中均有顯著性差異（P＜0.05）。這7種醇類物質，是白蘭地香氣組成中非常重要的幾類化合物，也是構成白蘭地骨架香氣的一部分[9-10，15]。對于單個化合物來說，D白蘭地中醇類含量最多的物質依次是：2-甲基丙醇（251.88 mg/L）、1-丙醇（143.14 mg/L）和正己醇（48.86 mg/L）。Q、F白蘭地中醇類物質含量最多的化合物依次是：1-丙醇、2-甲基丙醇、2-甲基丁醇和正己醇。2-甲基丙醇在Q、F白蘭地中檢測到，并未在D白蘭地中檢測出來。

萜烯類物質也是構成白蘭地香氣的重要組成成分，主要來源于葡萄本身，通常以苷的形式存在，在發酵過程中被游離出來，然后蒸餾進入白蘭地[16]。D白蘭地檢測到8種萜烯類物質，萜烯類總含量為49.52 mg/L；Q和F白蘭地均檢測到4種萜烯類物質，萜烯類總含量依次為是16.22 mg/L、14.77 mg/L，D白蘭地中萜烯類總含量是Q、F白蘭地中的3倍。大馬酮、紫羅蘭酮、TDN、1-萜品醇這4種萜烯類物質是在3種白蘭地中可以檢測到。但D白蘭地中這4種萜烯類物質含量與Q、F白蘭地有顯著性差異（P＜0.05）。紫羅蘭酮的含量在D白蘭地中最多（14.91 mg/L），占總萜烯類化合物總含量的30.11%。大馬酮在Q和F白蘭地中的含量是最多的，分別占總萜烯類化合物的60.29%、63.37%。大馬酮有蜂蜜的香味，對白蘭地的香氣有重要貢獻[9]，也有研究報道大馬酮對葡萄酒的香氣有重要影響[17]。乙酸松油脂、里那醇、（E）-橙花叔醇、香茅醇這4種萜烯類物質僅在D白蘭地中檢測到，未在其余2種白蘭地中檢測到。1,1,6-三甲基-1,2-二氫萘在葡萄酒中呈現汽油的味道[18]，但在白蘭地中也有檢測到[9]，且是作為白蘭地骨架香氣成分之一。

白蘭地中的有機酸類物質也是構成白蘭地香氣的一部分，其主要來源于葡萄本身，經過酵母的發酵過程，隨著蒸餾而進入到原白蘭地中。

D、Q、F白蘭地中均檢測到2種有機酸類化合物—辛酸和癸酸，總酸含量依次為28.51mg/L、26.55mg/L、13.37mg/L。根據研究報道，辛酸和癸酸的產生主要來自于葡萄發酵過程中醛類物質的氧化，其濃度主要取決于未發酵葡萄汁的初始發酵條件[19]。癸酸（21.52 mg/L）在D白蘭地中含量最多，占總酸含量的75.51%。在Q、F白蘭地中，酸類成分化合物含量最高是辛酸，各占64.91%、78.93%。癸酸在3種白蘭地中的含量差異性顯著（P＜0.05）。在本次實驗中，3種白蘭地產生酸的含量比較低，對白蘭地香氣的影響可以忽略不計。

醛酮類物質是構成白蘭地整體香氣不可或缺的重要組成部分。D、Q、F白蘭地中均檢測到4種醛酮類物質，總醛酮含量依次為1 521.12 mg/L、1 315.21 mg/L、1 257.3 mg/L。異丁醛、乙醛和庚醛是3種白蘭地共有醛酮類化合物，也是3種白蘭地醛酮類物質含量最豐富的化合物。在D白蘭地中檢測出上述3種醛酮類化合物的含量與Q、F白蘭地中的含量有顯著性差異（P＜0.05）。辛醛在Q、F白蘭地中檢測到，并未在D白蘭地中檢測到。癸醛在D白蘭地檢測到，但并未在Q、F白蘭地中檢測出來。庚醛是在3種白蘭地中醛酮類化合物含量最高（含量依次為1 404.28 mg/L、1 203.72 mg/L、1 150.72 mg/L）。相關研究表明，白蘭地中的醛酮類化合物可能來源于葡萄原料，又有可能來源于釀造白蘭地的過程中。但這些醛酮類化合物對白蘭地的風味有重要影響[20]。

D、Q、F白蘭地中均檢測出4種芳香類物質，總芳香類含量依次為96.80 mg/L、45.47 mg/L、43.02 mg/L。這3種白蘭地中的芳香類物質在種類上并未有差異性，主要表現在芳香類化合物含量的差異性。3種白蘭地中檢測到芳香類物質：乙酸2-苯乙酯、苯甲醛、苯乙醇和3,4,4a,5,6,7-六氫-1,1,4a-三甲基-2（1H）-萘酮。在D白蘭地檢測出的4種芳香類化合物含量與Q、F白蘭地有顯著差異性（P＜0.05）。乙酸2-苯乙酯在3種白蘭地中的含量是最高的，其次是苯乙醇。2-乙酸苯乙酯和苯乙醇具有淡雅細膩的玫瑰花香[21-22]，有研究認為2-乙酸苯乙酯對白蘭地呈現玫瑰花香起主導作用，也有研究認為苯乙醇起主要的作用[23]。苯甲醛具有典型水果的香氣，也是白蘭地香氣非常重要的芳香類化合物[10]。

D、Q、F白蘭地均檢測出7種縮醛類化合物，總縮醛類含量依次為687.53 mg/L、799.26 mg/L、768.76 mg/L?？s醛類物質與醛酮類物質類似，既可能來源于葡萄本身，也可能在白蘭地的生產過程中產生，又有可能在陳釀的過程中由其他的物質轉化而來，這些成分同樣對白蘭地的風味有著不可代替的作用，是構成白蘭地前香的重要組成部分[10]。從單個化合物上來說，1,1-二乙氧基乙烷在3種白蘭地中的含量是最多的，分別占總縮醛類含量的59.38%、49.55%、49.58%。D、Q、F白蘭地均檢測到1種含硫化合物—二甲基硫。二甲基硫在D白蘭地中含量最高（33.86 mg/L），其次是在F白蘭地（25.41 mg/L），最后是Q白蘭地（10.59 mg/L），在3種白蘭地中具有顯著性差異（P＜0.05）。含硫化合物由于低閾值以及獨特的香氣特征，目前已有相關的研究報道。如糠硫醇是芝麻型白酒中具有芝麻香氣特征的關鍵成分[24-25]。

2.2 揮發性成分的主成分分析

對3種不同酵母釀制的白蘭地主要的揮發性成分進行主成分分析，結果見圖1。由圖1可知，PC1和PC2對總方差的解釋率分別為72.1%和12.7%，前兩個主成分對初始數據總方差的解釋率為89.8%，可以體現不同釀酒酵母釀造的白蘭地香氣成分信息。

圖1 不同酵母釀造白蘭地樣品（A）及其揮發性成分（B）的主成分分析結果Fig.1 Principal component analysis results of brandy samples (A)brewed by different yeasts and volatile components (B)

3種不同酵母釀制的白蘭地樣品的主成分分析見圖1。由圖1A可知，由不同酵母釀制的白蘭地分布在不同的象限。D白蘭地樣品集中的分布在橫軸的負半軸，Q和F白蘭地樣品分散的分布在橫軸的正半軸。由此可見，以D254為酵母品種釀制的白蘭地可以與QA23、FC9型酵母白蘭地有明顯的差異。而QA23型酵母與FC9型酵母沒有明顯的差異性。

由圖1B可知，乙酸異丁酯、己酸乙酯、壬酸乙酯、9-癸烯酸乙酯、月桂酸乙酯、辛酸丙酯、異辛醇等這些化合物位于PC1的正半軸上，參考圖1A可知，這些化合物酵母QA23和FC9中的含量比較多。乙酸異戊酯、大馬酮、紫羅蘭酮、乙酸2-苯乙酯、苯乙醇、1-丙醇、2-甲基丁醇這些化合物位于PC1的負半軸，由圖1可知，這些化合物在酵母D254中的含量比較多。

3 結論

通過不同酵母發酵釀造得到3種不同的白蘭地，利用HS-SPME與GC-MS方法對白蘭地中的揮發性成分進行了定性、定量的檢測，總共得到69種揮發性成分，包括酯類29種、萜烯類8種、縮醛類7種、醛酮類5種、芳香類4種、醇類13種、有機酸類2種以及其他類1種。酵母D254產生的萜烯類、醛酮類、有機酸類和芳香類含量較高。酵母D254在本次實驗中產生的酸類物質含量雖然是最多的，但其相對含量比較低，所以并不會給白蘭地帶來不愉快的氣味。酵母QA23產生的酯類、醇類和縮醛類含量較高，白蘭地香氣濃郁且復雜，并且壬酸乙酯的含量在酯類物質中含量最高，具有芳香水果味，是構成白蘭地骨架香氣的關鍵成分。酵母FC9產生各類揮發性化合物含量比較均衡。

對不同酵母品種（D254、QA23、FC9）釀制的白蘭地中揮發性成分進行主成分分析，結果表明，選用D254型酵母與QA23、FC9型酵母有明顯的差異性。但對于QA23型與FC9型酵母，二者之間的差異性不明顯。

總的來說，本次實驗通過對3種不同酵母（D254、QA23、FC9）對白蘭地揮發性香氣成分的研究，可以揭示出不同酵母的特點，根據其酵母的特點，釀造出高品質的白蘭地。