纖維素酶高產菌篩選鑒定及酶學性質初步研究

李明華，孟秀梅，王成龍

（1.江蘇食品藥品職業技術學院 藥學院，江蘇 淮安 223003；2.江蘇食品藥品職業技術學院 食品學院，江蘇 淮安 223003）

纖維素是以葡萄糖為基本單位組成的大分子多糖，是構成植物細胞壁的最主要成分，其質量約占植物干質量的40%～50%[1]。纖維素是自然界中分布最廣、含量最多的可再生資源，每年僅由陸生生物合成的纖維素總量即達560～1 200億t[2]，是十分豐富的自然資源。但是，纖維素因結構極其穩定，僅有極少量被利用，絕大多數任由自然腐爛或燒掉，造成了極大的資源浪費和環境污染。纖維素經過降解轉化為葡萄糖后，可用作食品、能源和化工等行業原料，因此，纖維素的有效利用是解決全球食品短缺、能源危機和環境污染的重要途徑之一[3-4]。

目前，纖維素的降解可通過物理法、化學法和生物法進行[5]。但是，物理降解法效率低、能耗高，化學降解法副產物復雜、環境污染嚴重，而生物降解法因具有反應條件溫和、專一性高、綠色環保等優點，已受到越來越多科研工作者的青睞[6]。纖維素酶是可將纖維素降解為葡萄糖的多組分酶系，可廣泛應用于食品、飼料、能源、化工等眾多領域[7]。在自然界中，纖維素酶主要產自真菌和細菌，特別是絲狀真菌中木霉菌屬（Trichodermasp.）、青霉菌屬（Penicilliumsp.）和曲霉菌屬（Aspergillussp.）等所產纖維素酶組成豐富、結構合理，是纖維素酶生產的主要微生物[8-9]。但是，目前已有的產纖維素酶菌株或者酶活較低或者培養時間較長，嚴重制約著纖維素的高效利用[10]。因此，本研究通過真菌菌株篩選，旨在獲得纖維素酶高效生產菌株，以便為纖維素的綜合利用提供高活性酶。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 樣品

樣品采集于本校及周邊富含腐敗樹葉的楊樹林土壤，樣品于4 ℃冰箱保存備用。

1.1.2 試劑

真菌基因組脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）抽提試劑盒、膠回收試劑盒：天根生化科技（北京）有限公司；TaqDNA聚合酶、脫氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleoside triphosphates，dNTPs）、DNA marker：寶生物工程（大連）有限公司；蛋白胨、酵母粉：上海滬試實驗室器材股份有限公司；羧甲基纖維素鈉（sodiumcarboxymethylcellulose-Na，CMC-Na）、3,5-二硝基水楊酸（3,5-dinitrosalicylic acid，DNS）、剛果紅、葡萄糖等（均為分析純）：淮安國藥化學試劑有限公司。

1.1.3 培養基

CMC-Na 培養基：CMC-Na 20 g/L，Na2HPO42.5 g/L，KH2PO41.5 g/L，蛋白胨2.5 g/L，酵母浸粉0.5 g/L，調節pH 7.0～7.5。纖維素剛果紅培養基：青島海博生物技術有限公司；馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養基、馬鈴薯葡萄糖肉湯（potato dextrose broth，PDB）培養基：杭州微生物試劑公司。

1.2 儀器與設備

AL104分析天平：梅特勒托利多儀器公司；ZD-9556恒溫搖床：太倉市科教儀器廠；MJ-500F生化培養箱：上海一恒科學儀器有限公司；RXT-76TV光學顯微鏡：江南永新光學有限公司；722N可見分光光度計：上海菁華科技儀器有限公司；CL5R高速冷凍離心機：湖南湘儀離心機有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株初篩

將采集到的樣品2.5 g置于滅菌三角瓶中，加入25 mL無菌水和適量玻璃珠，旋渦振蕩器充分振蕩混勻后梯度稀釋。取不同稀釋度土壤懸液涂布于PDA固體平板培養基上，置于28 ℃培養箱中培養3～5 d。挑選具有不同顏色及形態的霉菌菌落點種到纖維素剛果紅固體平板上，置于28 ℃培養箱中培養至出現明顯的透明圈，根據透明圈直徑（D）和菌落直徑（d）的比值（D/d），初步篩選產纖維素酶能力較強的菌株并劃線保存于PDA斜面培養基[11]。

1.3.2 菌株復篩

將初篩獲得的菌株孢子接種至PDB培養基中，28 ℃、150 r/min條件下培養24 h后按5%（V/V）比例分別接種到CMC-Na培養基中，相同條件下培養4 d后，4 ℃、6 000 r/min離心8 min，取上清液作為粗酶液測定酶活，確定菌株產酶能力的高低[12]。

1.3.3 菌株形態鑒定

將菌種接種于PDA固體平板培養基上，28 ℃培養過程中觀察菌落形態、顏色及質地等菌落特征；挑取少許菌絲制成水浸片，在光學顯微鏡下觀察菌絲、孢子梗和孢子形態并拍照記錄[14]。

1.3.4 菌株分子生物學鑒定

參照真菌基因組提取試劑盒說明書，提取菌絲基因組DNA作為模板，以通用引物ITS1（5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'）和ITS4（5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'）通過聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）擴增內部轉錄間隔區（internal transcribed spacer，ITS）序列[15]，引物由上海生工合成。PCR擴增體系為：10×Buffer 2.5 μL，模板DNA1.5μL，dNTP2.0μL，上下游引物各1.0μL，Taq酶0.4 μL，ddH2O 16.6 μL，總體積25 μL；擴增條件為：95 ℃5 min，95 ℃30 s，55 ℃30 s，72 ℃30 s，24個循環后，72 ℃延長10 min。PCR產物經膠回收試劑盒回收、檢測確認后送上海生工測序。將測得序列與GenBank已知核酸序列進行基本局部比對搜索工具（basic local alignment search tool，BLAST）比對，采用Clustal W進行多序列匹配排列，最后用鄰接（neighborjoining，NJ）法通過MEGA6.06軟件構建系統發育樹[16]，確定菌株的種屬。

1.3.5 纖維素酶活測定

根據DNS法測定纖維素酶活性[13]。取1 mL粗酶液加入到含有1 mL 0.5%CMC-Na 溶液，5 mL 0.1 mol/L、pH5.0磷酸緩沖液中，迅速混勻后于50 ℃水浴孵育30 min后，立即加入5 mL DNS試劑終止反應，搖勻后沸水浴10 min，水浴冷卻后于540 nm波長下測定吸光度值。根據葡萄糖標準曲線（y=0.99x-0.015 7，R2=0.990 9）計算還原糖含量，求得酶活力。纖維素酶酶活定義為：50 ℃、pH5.0條件下，1 min內催化底物水解產生1 μmol葡萄糖的酶量為1個酶活單位（U）。

1.3.6 纖維素酶高產菌株產酶進程

將纖維素高產菌株劃線接種到PDA試管斜面上，28 ℃培養至產生大量孢子后，用含0.05%吐溫80的無菌水將孢子洗下，然后接種到PDB培養基中，28 ℃、150 r/min條件下培養24 h時，按5%（V/V）比例接種到150 mL CMC-Na培養基中，相同條件下培養，定時取樣，測定上清液纖維素酶活性。

1.3.7 纖維素酶性質測定

溫度對纖維素酶酶活的影響：取1 mL粗酶液加入含有1 mL 0.5%CMC-Na 溶液，5 mL 0.1 mol/L、pH5.0磷酸緩沖液中，分別在30～70 ℃的水浴中反應30 min，按1.3.5方法測定酶活，考察粗酶最適反應溫度。同時將粗酶液分別于20～80 ℃的水浴中處理1 h后，測定酶活并與未處理的酶液活性相比較計算相對酶活，確定酶熱穩定性。

pH對纖維素酶酶活影響：取1 mL粗酶液加入含有1 mL 0.5%CMC-Na溶液，5 mL 0.1 mol/L、pH4～8.5的磷酸緩沖液中，于最適反應溫度的水浴中反應30 min，測定酶活，確定粗酶的最佳反應pH。同時，將粗酶液pH分別調至pH 2～9，30 ℃靜置1 h后測定酶活，并與未處理的酶液活性相比較計算相對酶活，確定pH對酶穩定性的影響。

金屬離子對酶活性影響：分別在上述反應體系中添加不同種類金屬離子（K+、Ca2+、Mg2+、Fe2+、Mn2+、Cu2+、Co2+）至終濃度為1 mmol/L[17]，以不加金屬離子酶液活性為100%，測定添加金屬離子后的相對酶活，確定不同金屬離子對酶活的影響。

1.3.8 數據處理與統計

每組試驗重復3次，應用Excel 2010進行標準偏差分析并作圖，試驗結果以“平均值±標準偏差”表示。

2 結果與分析

2.1 菌種的分離篩選

將土壤懸液稀釋后涂布于PDA平板，然后挑選不同形態的菌株菌落點種到剛果紅培養基上，根據透明圈和菌落直徑的比值可初步判斷菌株產酶能力的大小[18]，共篩選出5株產酶能力較高的菌株，結果見表1。由表1可以看出，菌株SP08透明圈和菌落直徑比值（D/d）為1.37，大于其他4株菌，這在一定程度上表明該菌株產酶能力高于其它菌株。但是，該方法不能準確衡量菌株產酶及酶活力的大小，必須經發酵液酶活測定進一步確定[19]。將5株菌分別接種到CMC-Na液體培養基中，28 ℃、150 r/min條件下培養4 d，測定纖維素酶酶活，其中菌株SP08酶活最高，為（19.01±0.51）U/mL，因此選擇該菌進行進一步的研究。

表1 纖維素酶高產菌株酶活Table1 Enzyme activity of cellulase high-producing strain

2.2 菌株鑒定

2.2.1 菌株形態特征

菌株SP08的形態特征見圖1。菌株在PDA培養基上生長迅速，菌落起初為白色，絮狀，圓形，后淺黃色，直至整個菌落全部變成綠色，反面無色（圖1a）。光學顯微鏡下，菌絲有隔膜，向上伸出直立的分生孢子梗，分生孢子梗多分枝，小梗頂端有成簇的分生孢子，分生孢子橢圓形，無色，孢子壁粗糙（圖1b）。根據菌落形態及鏡檢結果，同時比對《真菌鑒定手冊》[20]初步鑒定該菌株為木霉（Trichodermasp.）。

圖1 菌株SP08菌落（a）和孢子及孢子梗（b）形態特征Fig.1 Morphological characteristics of colony (a),spore and conidiophore (b) of strain SP08

2.2.2 菌株分子生物學鑒定

在真核生物的相同物種之間，ITS序列高度同源，是用于物種鑒別的可信賴的基因標記[11，21]。以菌株SP08基因組DNA為模板，以ITS1和ITS4通用引物PCR擴增獲得629 bp的DNA片段，與預期ITS區域片段大小相符（圖2）。

圖2 菌株SP08 ITS序列PCR產物電泳圖Fig.2 Electrophoresis of PCR product of ITS sequence of strain SP08

應用BLAST程序，將該片段堿基序列與GenBank數據庫中的序列進行相似性比對，然后選擇同源性較高的8株菌株，應用MEGA6.06軟件構建系統進化樹，結果如圖3所示。由圖3可以看出，菌株SP08與Trichoderma koningiiACCC32842處于同一分支，親緣關系最近，相似率高達99%以上，結合該菌株菌落形態、孢子及孢子梗特征，可將該菌株鑒定為康氏木霉（Trichoderma koningii），并命名為T.koningiiSP08。

圖3 基于ITS序列菌株SP08的系統發育樹Fig.3 Phylogenetic tree of strain SP08 based on ITS sequence

2.3 菌株SP08纖維素酶產酶進程

菌株SP08隨時間產酶進程如圖4所示，隨著培養時間的延長，發酵液酶活逐漸升高，在培養至60 h時，酶活為（18.54±0.75）U/mL，72 h時酶活達到最高（19.18±0.68）U/mL，隨后酶活趨于穩定直至96 h后呈現下降趨勢。纖維素酶是菌株生長代謝過程中產生的，隨著菌體的增多，酶產量不斷積累，表現為酶活隨之升高，但培養至96 h后，可能酶發生部分變性失活，或菌體次級代謝產物抑制了酶的活力，從而導致酶活出現下降趨勢[22]。因此，在以下試驗中，當菌株培養至60 h時，即收獲粗酶液測定酶活，考察不同條件對酶活性的影響。

圖4 菌株SP08產纖維素酶進程Fig.4 Cellulase production process of strain SP08

2.4 酶學性質測定

2.4.1 纖維素酶最適反應溫度及熱穩定性

在不同溫度條件下，菌株SP08纖維素酶活性見圖5。由圖5a可知，菌株SP08纖維素酶活隨著反應溫度的升高而提高，在反應溫度為50 ℃時，酶活最高（18.71±0.82）U/mL，為該酶的最適反應溫度，進一步提高反應溫度，酶活則快速下降。這是因為隨著溫度升高，底物分子與酶有效碰撞率越大，反應就越快，但溫度過高反而加快酶的變性，造成酶活降低[23]。由圖5b可知，粗酶液在底于50 ℃水浴中加熱1 h，相對酶活＞85%；處理溫度超過50 ℃時，酶活損失較大，80 ℃處理1 h，相對酶活降至14.23%，說明該酶在低于50 ℃時能保持相對穩定。

圖5 纖維素酶最適反應溫度（a）及熱穩定性（b）Fig.5 Optimal reaction temperature (a) and thermal stability of cellulase

2.4.2 纖維素酶最適反應pH及pH穩定性

在不同pH的反應體系內，菌株SP08纖維素酶相對活性見圖6。由圖6a可知，該纖維素酶在pH4.5～6.0反應體系中活性最高，其中最適反應pH為5.5，活性為（18.92±0.63）U/mL；pH會影響到酶蛋白結構及與底物的結合能力，從而改變酶活力[24]，因此該酶在pH低于4.5或高于6.0時，活性迅速下降。粗酶液在不同pH下30 ℃保溫1 h后相對酶活見圖6b。由圖6b可知，菌株SP08纖維素酶在pH 4.0～6.0范圍內穩定性較高，相對酶活均＞75%，說明該酶在弱酸性條件下能夠保持相對穩定。因此該酶最適反應pH為5.5，處于最穩定的pH范圍內，非常有利于該酶的催化反應。

圖6 纖維素酶最適反應pH（a）及pH穩定性（b）Fig.6 Optimal reaction pH (a) and pH stability (b) of cellulase

2.4.3 金屬離子對酶活性影響

不同金屬離子對纖維素酶的內、外切酶酶活性影響不同，不同來源的纖維素酶所需作為激活劑的金屬離子也不同[25]。如圖7所示，在所測試金屬離子中，1 mmol/L的Fe2+和Cu2+能夠抑制菌株SP08纖維素酶活性，而Mg2+、Mn2+和Ca2+對該酶活性有明顯的促進作用，其中Mn2+和Ca2+使酶活分別提高了25.2%和18.52%。由此可見，在纖維素酶的應用過程中，金屬離子的合理選擇對酶的催化性能是非常重要的。

圖7 不同金屬離子對纖維素酶活的影響Fig.7 Effect of different metal ions on cellulase activity

3 結論

應用剛果紅染色法從土壤中分離到一株纖維素酶高產菌株SP08，經過形態學及分子生物學鑒定，確定該菌株為康氏木霉（Trichoderma koningii），并命名為T.koningiiSP08。菌株SP08生長速度快、產酶效率高，在CMC-Na培養基中培養72 h即可達到最高酶活（19.18±0.68）U/mL，而且該酶在最適反應溫度和pH時具有較高的穩定性，非常有利于酶解反應的進行。Mg2+、Mn2+和Ca2+對菌株SP08纖維素酶具有明顯的促進作用，而Fe2+和Cu2+卻抑制該酶的催化活性。對于該纖維素酶的具體特征及菌株產酶的最佳條件尚需進一步表征和優化。