榿葉唐棣果醋發酵工藝優化及有機酸和揮發性成分分析

于 杰，韓 菁，張卓睿，2，姜貴全

（1.北華大學 林學院，吉林 吉林 132013；2.長白山特色森林資源保育與高效利用國家林業局重點實驗室，吉林 吉林 132013）

榿葉唐棣（Amelanchier alnifoliaNutt.）薔薇科（Rosaceae）唐棣屬落葉灌木或小喬木，果實形似藍莓[1]，每100 g鮮果中含鈣為88 mg，又稱為高鈣果[2]。果實中富含果膠、花色苷以及多酚類和黃酮類化合物，果膠可以治療腹瀉、對預防高血壓和糖尿病等疾病具有良好效果[3-4]；花色苷具有降低膽固醇、保護心臟、預防心腦血管疾病等作用[5-6]；多酚類物質抗氧化活性高，效果優于維生素E，能夠調節血糖血脂、保護血管[7]；黃酮類化合物可通過細胞中蛋白質的合成來抑制白血病細胞生長[8]。

果醋是以水果或果品加工下腳料為主要原料，經酒精發酵和醋酸發酵釀制而成的一種兼具水果和食醋風味的新型飲品[9]，同時也是集保健食療為一體，營養豐富、風味優良的酸味調味品[10]。果醋中的風味物質醇類、酯類、醛類、酸類、酮類等物質[11-12]，有機酸作為果醋風味物質的主要成分，對果醋整體感官有重要的影響[13]。

本研究以榿葉唐棣為原料，采用半固態發酵法釀制榿葉唐棣果醋，以總酸含量為評價指標，研究并優化了榿葉唐棣果醋發酵工藝，并對其中有機酸及揮發性成分進行分析，以期為榿葉唐棣果醋的開發和生產提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

榿葉唐棣：2019年6月采摘于北華大學磨盤山實習基地，-80 ℃冷凍保藏。

果酒專用酵母：湖北安琪酵母股份有限公司；醋酸菌：煙臺帝伯仕自釀有限公司。

有機酸標準品（草酸、蘋果酸、酒石酸、丙二酸、乳酸、乙酸）（純度均＞98%）：上海精純試劑有限公司；磷酸二氫銨、磷酸、氫氧化鈉等（均為分析純），甲醇（色譜純）：天津致遠股份有限公司。

1.2 儀器與設備

HH-4數顯恒溫水浴鍋：國華電器有限公司；BSA224S電子天平：北京賽多利斯科學儀器有限公司；SPX-2500S-Ⅱ型生化培養箱：上海新苗醫療器械制造有限公司；LC-15C高效液相色譜儀（high performance liquid chromatograph，HPLC）（配備紫外檢測器和Essentia LCsolution 15C工作站）：日本島津公司；Agilent 5977C-7890B氣相色譜-質譜聯用儀（gas chromatography-mass spectrometer，GC-MS）：美國安捷倫儀器設備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 榿葉唐棣果醋發酵工藝流程及操作要點

榿葉唐棣果→自然解凍→挑選除雜→清洗→破碎→成分調整→酵母菌活化→接種酵母菌→酒精發酵→過濾→果酒、果渣復配→加麩皮、稻殼、醋酸菌→醋酸發酵→過濾→成品

操作要點：

挑選及預處理：選擇成熟度好、表面光滑、顏色紫紅、無病蟲害、無腐爛、無機械性損傷的榿葉唐棣果實，于室溫（25 ℃）條件下自然解凍后用蒸餾水清洗至表面清潔；

破碎：著潔凈的食品級一次性手套，進行手工破碎，避免打漿破碎過度；

成分調整：按酒精發酵最適宜的初始糖度含量（22%），在破碎好的榿葉唐棣果漿中加入綿白糖，攪拌均勻后備用。

果酒酵母活化：將蔗糖溶解于蒸餾水中，配制成為100 g/L的糖液，加入果酒酵母（糖液與果酒酵母質量比為10∶1），輕微攪拌，在29 ℃水浴鍋中活化20 min，當溶液冒出很多細小氣泡時，酵母活化完成。

酒精發酵：按酒精發酵最適宜的酵母菌添加量（2%），向榿葉唐棣果漿中加入活化好的果酒酵母，攪拌均勻，倒入容器，裝罐量占容器容量的2/3，容器口用保鮮膜密封，放入培養箱中靜置發酵，30 ℃發酵9 d。

過濾：果酒經過500目紗布自然沉降過濾。

醋酸發酵：發酵所需的容器都要經過嚴格的滅菌，防止在發酵過程中受到其他雜菌污染，滅菌后加入適量麩皮、稻殼，果酒與酒渣體積占容器容量的1/2，用兩層紗布覆蓋，放入培養箱中在一定溫度條件下靜置有氧發酵，在發酵過程中注意時常攪拌，防止果醋發干變臭。

過濾：果醋經過500目紗布過濾，得到果醋成品。

1.3.2 榿葉唐棣果醋醋酸發酵條件優化單因素試驗

以總酸含量為評定指標，分別考察初始酒精度（5%vol、7%vol、9%vol、11%vol、13%vol），果酒果渣質量比（1∶1、1∶1.4、1∶1.6、1∶1.8、1∶2），發酵溫度（24 ℃、27 ℃、30 ℃、33 ℃、36 ℃），醋酸菌添加量（1.6%、1.8%、2.0%、2.2%、2.4%）對醋酸發酵的影響。

1.3.3 榿葉唐棣果醋醋酸發酵條件優化正交試驗

在單因素試驗的基礎上設計L9（34）正交試驗，以初始酒精度（A）、發酵溫度（B）、醋酸菌添加量（C）、果酒果渣質量比（D）為評價因素，以總酸含量為考察指標，優化榿葉唐棣果醋醋酸發酵條件，正交試驗因素與水平見表1。

表1 榿葉唐棣果醋醋酸發酵條件優化正交試驗因素與水平Table1 Factors and levels of orthogonal tests for acetic acid fermentation conditions optimization of Aelanchier alnifolia fruit vinegar

1.3.4 測定方法

酒精度的測定：參照GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》中的酒精計法[14]；總酸的測定：參照GB/T 12456—2008《食品中總酸的測定》中的pH電位法[15]。

有機酸含量的測定：①樣品預處理：原果汁和優化發酵條件后的榿葉唐棣果醋，過200目紗布，取5.00 mL待測樣品，加入2.00 g聚酰胺后于70 ℃水浴鍋中加熱5 min，于3 000 r/min條件下離心10 min，取上清液加入2.00 mL 1 mol/L磷酸溶液和5.00 mL蒸餾水，過0.45 μm濾膜，備用。②色譜條件：參考GB 5009.157—2016《食品有機酸的測定》中果汁飲料及果汁、果味碳酸飲料的方法[16]。

有機酸定性定量方法：將樣品的保留時間與標準品保留時間作對照進行定性，采用內標標準曲線法對樣品含量進行定量。

揮發性成分的測定采用GC-MS法。①樣品預處理：參考彭幫柱等[17]的方法。②氣相色譜（GC）條件：色譜柱為HP-5ms（30 m×0.32 mm，0.25 μm）；進樣口溫度250 ℃；載氣氦氣（He）（純度＞99.999%）；流速1.0 mL/min；不分流進樣。程序升溫，起始溫度為40 ℃于10 min后，以3 ℃/min升溫至85 ℃，保持2 min，然后以5 ℃/min升溫至110 ℃，保持2 min；最后以8 ℃/min升溫至230 ℃，保持8 min。質譜（MS）條件：電子電離（electron ionization，EI）源；電子能量70 eV；離子源溫度230 ℃；四極桿溫度150 ℃；質量掃描范圍為35～400 m/z。

揮發性成分定性定量方法：將GC-MS檢測的未知化合物的圖譜與美國國家標準與技術研究院（national insititute of standards and technology，NIST）譜庫II并結合文獻報道的保留指數（retention index，RI）進行比對定性。采用內標標準曲線法對樣品含量進行定量。

1.3.5 數據統計分析

采用Excel 2016對實驗數據進行錄入、計算，采用Origin 8.0軟件進行作圖。

2 結果與分析

2.1 榿葉唐棣果醋發酵條件優化

2.1.1 發酵時間的確定

由圖1可知，隨著發酵時間的延長，榿葉唐棣果醋產酸量也隨之增加，在發酵初期醋酸菌處于生長繁殖階段，導致產酸量較低，當發酵到12 d時產酸量開始大量增加，產酸明顯，當發酵到18 d時，產酸量達到峰值，為3.66 g/100 mL，當發酵到21 d時，產酸量開始下降，由于前期酸的積累使醋酸菌生長受到抑制，產酸量下降。因此，確定18 d為最佳發酵時間。

圖1 發酵時間對榿葉唐棣果醋總酸含量的影響Fig.1 Effect of fermentation time on total acid content of Aelanchier alnifolia fruit vinegar

2.1.2 初始酒精度的確定

由圖2可知，在醋酸發酵初期產酸量都較低，因為醋酸菌處于生長繁殖階段，產酸效果未表現出來；初始酒精度較低時，產酸量在整個發酵過程中較少，是因為醋酸菌可利用的酒精含量過低導致產酸量過少；初始酒精度過高時，產酸量在整個發酵過程中幾乎無變化，是由于酒精度過高使醋酸菌不耐受，醋酸菌在整個發酵過程中受到抑制[18]，初始酒精度為9%vol時，產酸量在第18天出現峰值，為3.8 g/100 mL。因此，確定初始酒精度為9%vol。

圖2 初始酒精度對榿葉唐棣果醋總酸的影響Fig.2 Effect of initial alcohol contents on total acid contents of Aelanchier alnifolia fruit vinegar

2.1.3 果酒果渣質量比的確定

由圖3可知，在發酵初期產酸都較少，當果酒與果渣復配比例相對較低為1∶1時，由于容器中氧氣含量相對較高，醋酸菌大量生長繁殖代謝旺盛，發酵過程結束過早[19]；果酒與果渣復配比例為1∶2時，產酸量在第15天出現峰值，而后下降，由于容器中氧氣流通不足，醋酸菌生命活動受到抑制，在發酵后期產酸量降低；果酒與果渣復配比例為1∶1.6時，產酸量在第18天出現峰值，為3.12 g/100 mL。因此，確定果酒與果渣復配比例為1∶1.6。

圖3 果酒果渣質量比對榿葉唐棣果醋總酸的影響Fig.3 Effect of mass ratio of fruit wine and pomace on total acid contents of Aelanchier alnifolia fruit vinegar

2.1.4 醋酸菌添加量的確定

由圖4可知，隨著醋酸菌添加量的增加，產酸量隨之增加；在發酵初期，過少的添加量產酸量相對較少；過高的添加量會使醋酸菌發生自溶現象，產生大量的代謝廢物，影響醋酸菌的生長繁殖，在醋酸發酵后期產酸量降低[20]，醋酸菌添加量為2.0%時，在發酵末期的產酸量相對較多，第18天產酸量達到峰值，為3.65 g/100 mL。因此，確定醋酸菌添加量為2.0%。

圖4 醋酸菌添加量對榿葉唐棣果醋總酸含量的影響Fig.4 Effect of acetic acid bacteria addition on total acid contents of Aelanchier alnifolia fruit vinegar

2.1.5 發酵溫度的確定

由圖5可知，在發酵初期，隨著溫度的升高，產酸量隨之增加；過低的溫度會影響醋酸菌的生長，不易存活，導致發酵不完全，產酸量相對較少；過高的溫度會使酸大量揮發，醋酸菌老化死亡，在醋酸發酵后期產酸量降低[20]，發酵溫度為30 ℃時，總酸含量在第18天達到峰值，為3.71 g/100 mL。因此，確定發酵溫度為30 ℃。

圖5 發酵溫度對榿葉唐棣果醋總酸含量的影響Fig.5 Effect of fermentation temperature on total acid contents of Aelanchier alnifolia fruit vinegar

2.1.6 醋酸發酵條件優化正交試驗

由表2可知，正交試驗中的最佳工藝組合為A2B2C2D3，即初始酒精度9%vol，發酵溫度30 ℃，醋酸菌添加量2.0%，果酒與果渣質量比1.0∶1.6，在此條件下榿葉唐棣果醋總酸含量為4.75 g/100 mL，結合單因素試驗，總酸含量峰值均出現在第18天，因此將第18天確定為醋酸發酵終止時間。

表2 榿葉唐棣果醋醋酸發酵條件優化正交試驗結果與分析Table2 Results and analysis of orthogonal tests for acetic acid fermentation conditions optimization of Aelanchier alnifolia fruit vinegar

由表3可知，在發酵過程中，初始酒精度（A）和發酵溫度（B）對榿葉唐棣果醋的總酸含量影響極顯著（P＜0.01），醋酸菌添加量（C）對榿葉唐棣果醋的總酸含量影響顯著（P＜0.05），果酒與果渣質量比（D）影響不顯著（P＞0.05）。

表3 正交試驗結果方差分析Table3 Variance analysis of orthogonal tests results

2.2 有機酸組成分析

采用反相高效液相色譜法對榿葉唐棣原果汁和果醋中的有機酸進行定性和定量分析，結果見表4。

表4 榿葉唐棣果汁和果醋有機酸含量分析結果Table4 Analysis results of organic acid content in Amelanchier alnifolia juice and fruit vinegar

由表4可知，榿葉唐棣果汁中蘋果酸含量最高為1.20 mg/mL，丙二酸次之，為0.47 mg/mL，草酸和乙酸含量相對較低，這些有機酸構成了榿葉唐棣漿果獨特的口感；榿葉唐棣果醋中，乙酸含量最高為5.00 g/100 mL，其次是丙二酸和乳酸，分別為0.43 mg/mL、0.25 mg/mL。與榿葉唐棣果汁相比，榿葉唐棣果醋中蘋果酸含量明顯降低，這是由于酒精發酵過程中部分蘋果酸被轉化成酒精和乳酸，因此蘋果酸含量下降，隨著醋酸發酵的進行，榿葉唐棣果醋中蘋果酸、丙二酸含量持續下降，在醋酸發酵過程中醋酸菌利用乙醇發酵產生大量乙酸，造成乙酸含量突增，同時有一部分糖發酵不完全轉化成了乳酸，使得乳酸含量相對增加[21]。

2.3 揮發性成分組成分析

榿葉唐棣果汁和果醋揮發性成分分析結果見表5。

由表5可知，榿葉唐棣果汁中分離出6種化合物，分別為乙酸-3-甲基丁酯、乙酸乙酯、苯甲醛、丁酸、苯甲醇、2-甲氧基-4-乙烯苯酚，其中苯甲醛（73.53%）含量相對較高，是榿葉唐棣果汁中揮發性成分的主要組分，具有苦杏仁味。從榿葉唐棣果醋中分離出5種化合物，分別為3-羥基-2-丁酮、乙酸、乙酸乙酯、苯甲酸、苯甲醇，其中乙酸（35.62%）含量最高，是榿葉唐棣果醋中揮發性成分的主要組分，具有刺激性的酸味，乙酸乙酯（24.32%）含量次之，具有酯香和果香。隨著酒精發酵過程的進行，酵母菌利用糖進行無氧發酵產生大量乙醇，使得進行醋酸發酵之前就已經具有香氣較為復雜；當進行到醋酸發酵階段，醋酸菌利用乙醇有氧發酵產生大量乙酸，發酵液具有明顯的醋酸味，同時乙酸與乙醇酯化生成乙酸乙酯，構成了果醋的獨特香味[22-25]。

表5 榿葉唐棣果汁和果醋揮發性成分分析結果Table5 Analysis results of volatile components in Amelanchier alnifolia juice and fruit vinegar

3 結論

榿葉唐棣營養價值相對較高，可以用來發酵果酒和果醋，通過試驗分析，確定了榿葉唐棣果醋醋酸發酵最佳條件為初始酒精度9%vol，果酒與果渣質量比1.0∶1.6，醋酸菌添加量2.0%，發酵溫度30 ℃，醋酸發酵時間18 d。其中，初始酒精度和發酵溫度為影響醋酸發酵的極顯著性因素，酵母添加量為顯著性因素。在此條件下進行發酵，總酸含量為4.75 g/100 mL。

榿葉唐棣果醋的6種有機酸中乙酸（5.00 mg/mL）含量最高，乳酸（0.25 mg/mL）和丙二酸（0.43 mg/mL）次之。5種揮發性成分分別是3-羥基-2-丁酮、乙酸、乙酸乙酯、苯甲酸、苯甲醇，其中含量較高的是乙酸（35.62%）和乙酸乙酯（24.32%）。在發酵過程中，榿葉唐棣果汁香氣較為酸澀，有榿葉唐棣獨特的果酸味，而榿葉唐棣果醋成分復雜多樣，集酯香、果香以及醋的酸味于一體，香氣宜人且濃郁。