啤酒中鄰苯二甲酸酯檢測方法優化及遷移量研究

呂慧威，耿 迪，解 慧，郭 燦，蔡 勇，楊 剛*

（1.吉林師范大學 博達學院 食品科學與工程學院，吉林 四平 136000；2.四平金士百純生啤酒有限公司，吉林 四平 136001；3.長春職業技術學院 食品生物技術分院，吉林 長春 130033）

啤酒包裝的瓶蓋內墊具有密封的作用，在加工過程中需要加入一定量增塑物質來改善材料的低溫性能，提高其柔軟度[1]，其基材多采用聚氯乙烯（polyvinyl chloride，PVC）[2]、聚乙烯（polyethylene，PE）[3]等材料。鄰苯二甲酸酯類是全球塑料生產中最常用的增塑劑，尤其是聚氯乙烯塑料（PVC）的塑化劑和軟化劑[4]，其用量占世界全年增塑劑消耗量的90%[5-6]。國內超過60%的PVC瓶蓋內墊含有鄰苯二甲酸酯（phthalate esters，PAEs）類增塑劑，在瓶蓋內墊中PAEs的用量可達到50%左右，其中大部分是鄰苯二甲酸二（2-乙基）己酯（di（2-ethyl）hexyl phthalate，DEHP）[7]。目前，國內外對啤酒包裝瓶蓋內墊潛在的安全性問題越來越關注[8-9]。隨著居民收入和消費水平的提高，我國啤酒消費量日益增長，因而，對啤酒中PAEs的檢測尤為重要[10]。

鄰苯二甲酸酯類增塑劑有一定毒性、呈無色無味液體，不允許作為添加劑或加工助劑添加到食物中[12]，其中DEHP的危害較大，是一種環境激素，其毒性比三聚氰胺高20倍，對人體的生殖系統和生育能力有影響，干擾內分泌，是導致人類生育能力降低的罪魁禍首[13-14]。長期大量攝取還會導致乳腺癌和肝癌，微量塑化劑在24～48 h可以排出體外[15]。很多國家對食品及其包裝材料PAEs的使用和限量都有明確要求，日本、希臘、挪威等國要求禁止將PAEs用在聚氯乙烯等食品包裝材料中；歐盟新《食品接觸塑料材料和制品法規》中規定在用作與非脂肪類食品接觸的重復使用材料和制品中鄰苯二甲酸二丁酯（dibutyl phthalate，DBP）含量不能超過0.05%，DEHP、鄰苯二甲酸二異壬酯（diisononyl phthalate，DINP）、鄰苯二甲酸二異癸酯（didecyl phthalate，DIDP）和鄰苯二甲酸苯基丁酯（butyl benzyl phthalate，BBP）含量不能超過0.1%，鄰苯二甲酸二烯丙酯（diallyl phthalate，DAP）不得檢出[16]；美國環境保護署（US Environmental Protection Agency，EPA）規定飲用水中DEHP的限量為6 μg/L[17-18]，我國生活飲用水衛生標準對DEHP的限量規定為8 μg/L[19]。

PAEs廣泛存在于環境中，但因其含量極低，通常為mg/kg，因此對樣品檢測的前處理、儀器設備及人員的操作等要求都非常嚴格。近年來，各國紛紛頒布出鄰苯二甲酸酯類物質的分析檢測方法標準，如歐盟EN14372—2004《兒童喂養餐具的安全要求及測試》、歐盟BSEN 15777—2009《紡織品鄰苯二甲酸酯的測定方法》、美國消費品安全委員會（Consumer Product Safety Commission，CPSC）-CH-C1001-09.3《兒童玩具和護理品中鄰苯二甲酸酯的測試方法》、美國CPSC-CH-C1001-09.3ASTMD 3421-75《鄰苯二甲酸酯測定方法標準》[20]，我國2016年發布了GB 5009.271—2016《食品安全國家標準食品中鄰苯二甲酸酯的測定》[21-22]。針對啤酒樣品，目前我國還沒有專門針對其中PAEs的檢測方法標準，檢測只能參照食品中PAEs的檢測標準，但在GB 5009.271—2016 中只對食品大類的PAEs檢測方法做出了要求，沒有對細分種類的檢出限做出區分，方法中標出檢出限DLDINP=9.0 mg/kg，DLDBP=0.3 mg/kg，其他16種目標化合物定量限均為0.5 mg/kg，而對含量較低該檢出限的食品，該方法并不適用。如DBP和DEHP是我國地表水環境質量標準的檢測項目，檢出限（detection limit，DL）為DLDBP=0.1 μg/L，DLDEHP=0.4 μg/L[23]；劉靖靖等[20]對啤酒的PAEs檢測結果顯示，市售的30種啤酒樣品PAEs 含量在0.77～16.67 μg/L 范圍內，均低于GB 5009.271—2016中的檢出限。因此，針對啤酒樣品，建立靈敏、精準、高效的樣品前處理方法及分析檢測方法對啤酒的質量安全控制是極其重要的。

本研究建立了頂空固相微萃取-氣質聯用法（headspace solid-phase microextraction-gas chromatography-mass spectrometry HS-SPME-GC-MS）分析啤酒中塑化劑鄰苯二甲酸酯的測定方法，采用單點標準加入法測定了6種市售啤酒以及在3種遷移試驗條件下瓶蓋內墊片在啤酒和模擬物中PAEs的遷移量，為啤酒行業評估PVC和PE瓶蓋內墊片問題奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

16種PAEs混標具體名稱見表1。

表1 鄰苯二甲酸酯類目標化合物名稱Table1 Name of phthalate esters target compound

混標各組分質量濃度為1 000 mg/L（正己烷溶劑）：廣州太瑋生物公司；正己烷、甲醇（junwei1色譜級）：百靈威科技有限公司；啤酒樣品：超市采購；啤酒瓶蓋內墊：某包裝企業提供；高純氦氣（純度≥99.99%）、高純氮氣（純度≥99.95%）、高純二氧化碳（純度≥99.5%）：四平健新氣體有限公司。

1.2 儀器與設備

Clarus600氣相色譜-質譜聯用儀（配有自動進樣器、電子電離源）：美國珀金埃爾默儀器有限公司；DB-5MS毛細管色譜柱（30 m×0.32 mm×0.25 μm）：美國Agilent公司；50 μm DVB/CAR/PDMS萃取頭的固相微萃取裝置（solid phase micro extraction process，SPME）：美國Supelco公司；UGC-12MF氮吹儀：北京優晟聯合科技有限公司；2101TH超聲波清洗器：上海安譜科學儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 標準溶液的配制

PAEs混標儲備液：將PAEs標樣用正己烷定容至10 mL，配制成質量濃度為100 mg/L的儲備液，于4 ℃冰箱保存。

PAEs混標使用液：取16種PAEs混標儲備液1mL于10 mL容量瓶中，用氮吹儀吹干，加甲醇復溶，定容至10 mL，質量濃度為10 mg/L，于4 ℃冰箱保存待用。

1.3.2 啤酒中鄰苯二甲酸酯類化合物的檢測[20，24]

采用頂空固相微萃取-氣質聯用（HS-SPME-GC-MS）法測定。

GC條件色譜柱：DB-5MS石英毛細管柱（30m×0.32 mm×0.25 μm）。程序升溫：初溫為60 ℃，保持1 min，以20 ℃/min升至220 ℃，保持1 min，再以5 ℃/min升至280 ℃，保持4 min。進樣口溫度：250 ℃；不分流模式：進樣0.75 min前不分流，之后流速為10.0 mL/min；恒流模式：流量為1.0 mL/min；載氣為氦氣（He）（純度≥99.999%）；流速1 mL/min。

MS條件：電離方式采用電子電離（electctron ionization，EI）源；電子能量70eV；離子源溫度230℃；傳輸線溫度280℃；測定模式為選擇離子監測（selected ion monitoring，SIM），溶劑延遲7 min；全掃描質核比范圍為29～350 amu。

1.3.3 樣品處理[25]

啤酒瓶蓋墊片：將墊片破碎至最大顆粒不超過0.02 g，準確稱取0.2 g試樣（精確至0.1 mg）于100 mL具塞三角瓶中，加入20 mL正己烷，超聲提取30 min，單層濾紙過濾，再用正己烷重復上述操作3次，每次10 mL，合并提取液用正己烷定容至50 mL，進行GC-MS分析，同時做試劑空白試驗。

啤酒樣品：啤酒樣品超聲20 min除氣，取10 mL注入20 mL頂空瓶中，加蓋密封。將SPME手柄插入頂空瓶中，推出萃取頭水浴保溫一段時間后進行GC-MS分析，解吸時間為5 min。

2 結果與分析

2.1 PAEs組分的定性和定量分析

2.1.1 PAEs組分的總離子流圖

16種PAEs混標直接進樣后獲得的總離子流色譜圖見圖1。由圖1可以看出，各組分的峰形基本對稱，分離效果較好。

圖1 16種鄰苯二甲酸酯混標總離子流色譜圖Fig.1 Total ion chromatogram of 16 plasticizer phthalate acid esters mixed standard

2.1.2 PAEs組分信息匯總

采用頂空固相微萃取法萃取樣品，定性方法采用選擇離子掃描，定量時采用積于多離子比例定量，每個化合物選擇1個定量離子，3個定性離子，這樣定性、定量更為準確。通過對16種鄰苯二甲酸酯（PAEs）組分的定性分析，得到其信息匯總見表2。

表2 16種鄰苯二甲酸酯信息匯總Table2 Information aggregation of 16 phthalate acid esters

2.2 萃取條件的優化

對于頂空固相微萃取法，萃取效果影響較大的因素是溫度和時間，萃取溫度和時間對鄰苯二甲酸酯類化合物（DIBP、DBP、DEHP）的影響結果見圖2。

由圖2可知，DIBP、DBP和DEHP三種物質的含量隨萃取時間的延長，整體都呈上升趨勢，55 ℃水浴保溫60 min和65 ℃水浴保溫60 min萃取效果相差不大，說明達到一定溫度和時間時，萃取頭吸附已接近飽和而對于萃取頭來說，長時間高溫萃取容易造成萃取頭老化加速甚至脫落，而且55 ℃條件較65 ℃條件更有利于檢測結果的穩定，重現性較好。綜合因素考慮，選取55 ℃水浴保溫60 min條件進行萃取效果最好。

圖2 萃取時間及溫度對鄰苯二甲酸酯類化合物組分（DIBP、DBP、DEHP）含量的影響Fig.2 Effect of extraction time and temperature on phthalate acid esters components (DIBP、DBP、DEHP) contents

2.3 啤酒瓶蓋內墊片中PAEs的定量分析

對于啤酒中痕量PAEs的來源，很少有相關的報道，有人推斷啤酒瓶蓋的PVC內墊片可能對其有影響。為了驗證瓶蓋內墊對啤酒酒液中PAEs的影響，對本地某啤酒企業目前所使用的啤酒瓶蓋A廠PVC內墊片的23個樣品、B廠PE內墊片的26個樣品和C廠PE內墊片的21個樣品進行了測定，其中共檢出DIBP、DBP和DEHP三種PAEs，其結果平均值見表3。

表3 不同廠家不同材質的瓶蓋內墊片中鄰苯二甲酸酯類化合物組分含量Table3 Contents of phthalate acid esters components in bottle cap gaskets made of different materials from different manufacturers

由表3可知，PVC和PE內墊片差異很大，PVC內墊片的DEHP含量很高，達到179 214 mg/kg，而PE內墊片僅為6.25 mg/kg，兩者相差3萬倍左右，作為與啤酒直接接觸的材料，PVC內墊片是存在一定風險的。在2014年中國酒業協會啤酒分會年會上，就啤酒及啤酒瓶蓋內墊塑化劑問題展開過專題討論，協會責成各大啤酒龍頭企業牽頭，將PVC內墊逐步替換為PE內墊，現大部分企業已經開始、正在進行更換，甚至已經更換完畢，但仍有部分企業更換進展很慢，存在一定的安全隱患。

2.4 啤酒中PAEs的定量分析

采用單點標準加入法做定量分析，計算啤酒中PAEs的含量。通過前期對大量啤酒樣品的檢測發現，所選樣品范圍內僅能檢出DIBP、DBP和DEHP三種物質，其余13種均為未檢出，在此，僅對這三種物質進行分析。采用此方法測定了6種市售啤酒，啤酒中所含的3種PAEs組分含量見表3，結果為三個平行樣品的平均值。

由表4可知，啤酒中也含有痕量的PAEs，其含量均為μg/L級，DBP含量稍高，在1.41～8.45 μg/L之間，而DIBP在0.79～3.62 μg/L之間，DEHP在≤7.88 μg/L。我國對于食品中的PAEs限量尚無要求，如果比照我國生活飲用水衛生標準對DEHP的限量為8 μg/L[18]的規定，啤酒樣品并未超標，但檢測結果已經接近飲用水的限量值，應該采取更新包裝材料等手段進行干預，避免其含量過高，也期待啤酒的相應標準盡快出臺。

表4 啤酒中3種鄰苯二甲酸酯類化合物組分（DIBP、DBP、DEHP）的含量Table4 Contents of 3 phthalate acid esters components (DIBP、DBP、DEHP) in beer

2.5 遷移量試驗

為研究啤酒瓶蓋內墊片在啤酒中遷移量的問題，根據GB/T 23296.1—2009《食品接觸材料塑料中物質向食品及食品模擬物特定遷移試驗和含量測定方法以及食品模擬物暴露條件選擇的指南》中對遷移試驗條件的相關規定以及啤酒實際儲存的條件[26]，選取了3種遷移試驗條件，即70 ℃保溫1 h、20 ℃儲存10 d、40 ℃儲存10 d，通常被認為更嚴厲的試驗條件為40 ℃儲存10 d[27]，啤酒和模擬物樣品應橫放在培養箱中儲存。

2.5.1 溫度及時間對PVC內墊片在啤酒中PAEs遷移量的影響

測定啤酒本底的含量以及在3種遷移試驗條件下的遷移量，結果見圖3。

圖3 溫度及時間對PVC內墊片在啤酒中鄰苯二甲酸酯類化合物組分（DIBP、DBP、DEHP）遷移量的影響Fig.3 Effect of temperature and time on phthalate acid esters components (DIBP、DBP、DEHP) migration of PVC inner gasket in beer

由圖3可知，在70 ℃保溫1 h、20 ℃儲存10 d、40 ℃儲存10 d的條件下，PVC內墊片在啤酒中DIBP的含量是啤酒本底的1.3～2.0倍，DBP是2.0～5.9倍，DEHP是1.7～8.3倍，DEHP的含量增加尤為顯著。因此，從整體的遷移量角度出發，發現：在40 ℃、儲存10 d的條件下，DBP的含量最高為9.48 μg/L，DIBP的含量最高為1.88 μg/L，DEHP的含量最高為1.89 μg/L。通過上述得出PVC內墊片中的DBP在較高的溫度且較長的儲存條件下，DBP較其他兩者更易遷移至啤酒中。

2.5.2 溫度及時間對PE內墊片在啤酒中PAEs遷移量的影響

測定啤酒本底的含量以及在3種遷移試驗條件下的遷移量，結果見圖4。

圖4 溫度及時間對PE瓶蓋內墊片在啤酒中鄰苯二甲酸酯類化合物組分（DIBP、DBP、DEHP）遷移量的影響Fig.4 Effect of temperature and time on phthalate acid esters components (DIBP、DBP、DEHP) migration of PE bottle cap inner gasket in beer

由圖4可知，在70 ℃保溫1 h、20 ℃儲存10 d、40 ℃儲存10 d的條件下，PE內墊片在啤酒中DIBP的含量是啤酒本底的1.3～1.9倍，DBP是1.4～3.0倍，DEHP是3.2～4.0倍。因此，從整體遷移量來看，在40 ℃、儲存10 d的條件下DBP含量最高為8.26 μg/L，DIBP含量最高為1.73 μg/L，DEHP含量最高為1.46 μg/L，結合2.5.1結論可知：PE內墊片中的DBP較其它兩者更易遷移至啤酒中，而且PVC內墊片中的三者的含量均要高于PE內墊片中的三者含量。

2.5.3 溫度及時間對PVC內墊片在模擬物中PAEs遷移量的影響

測定模擬物本底的含量以及在3種遷移試驗條件下的遷移量，結果見圖5。

圖5 溫度及時間對PVC內墊片在模擬物中鄰苯二甲酸酯類化合物組分（DIBP、DBP、DEHP）組分遷移量的影響Fig.5 Effect of temperature and time on phthalate acid esters components (DIBP、DBP、DEHP) migration of PVC inner gaskets in simulators

由圖5可知，在70 ℃保溫1 h、20 ℃儲存10 d、40 ℃儲存10 d的條件下，PE瓶蓋內墊片在啤酒中DIBP的含量是啤酒本底的1.2～1.7倍，DBP是1.6～3.7倍，DEHP是0.3～7.6倍，DEHP的含量增加也是顯著的。因此，從整體遷移量的角度出發，在40 ℃，儲存10 d的條件下，PVC內墊片中的DEHP在模擬物（10%含量的乙醇溶液）中的含量最高為7.55 μg/L，DBP的含量為3.04 μg/L，DIBP的含量為1.16 μg/L，說明在較高的溫度且較長的儲存時間下，DEHP更易溶于較高含量的乙醇溶液，而DEHP在酒精含量相對較低的啤酒中的遷移量最少。

總結圖3～圖5的結果，溫度及時間是啤酒中PAEs增加的重要因素，而且通過試驗結果可知啤酒在正常條件下儲存，其中的DIBP、DBP與DEHP的含量是不會達到上述試驗中的遷移量。在夏季時，啤酒放在冰箱里冷藏飲用、在運輸過程中超過30 ℃，這些都是常有的現象，因此應嚴格禁止將啤酒橫放、倒放或高溫儲存，避免酒液接觸內墊片。

3 結論

本試驗研究優化了采用頂空固相微萃取-氣質聯用法測定啤酒中鄰苯二甲酸酯的方法，該方法操作簡單，靈敏度較高，試驗檢測結果表明，啤酒中所含3種PAEs組分，即DIBP、DBP、DEHP，而且含量較低。PVC內墊片中DBP的含量高達9.48 μg/L，PE內墊片為8.26 μg/L。在遷移試驗中，PVC、PE內墊片中DEHP在啤酒中的遷移量有所提高，但在PVC內墊片中DEHP在模擬物中即10%含量的乙醇溶液中的遷移量更為顯著。溫度及時間是啤酒中PAEs增加的一個重要因素，應嚴格禁止將啤酒橫放、倒放或高溫儲存，避免酒液接觸內墊片。