超期儲存小麥與水稻混合發酵生產燃料乙醇的研究

周娜娜，李永恒，孫振江，何太波，王小艷，佟 毅，王澤興，張俊奇，陳凡榮，李 凡，*

（1.中糧營養健康研究院有限公司，北京 102209；2.廣西中糧生物質能源有限公司，廣西 北海 536100；3.中糧生化能源（肇東）有限公司，黑龍江 肇東 151100；4.中糧生物科技股份有限公司，安徽 蚌埠 233010；5.玉米深加工國家工程研究中心，吉林 長春 130033）

燃料乙醇作為一種清潔的可再生能源，具有資源豐富、碳沉積少、減少溫室氣體排放等優點[1-3]。21世紀期初期我國開始發展燃料乙醇[4]，隨著車用燃料乙醇方案的推廣，燃料乙醇行業發展迅速，成為可再生能源的重要組成部分[5-8]。

燃料乙醇發酵主要原料包括谷物原料、薯類原料、糖質原料以及纖維素原料，其中淀粉質原料主要為玉米、小麥、水稻和木薯等[9-10]。隨著燃料乙醇行業的迅速發展，原料逐漸由單一原料向混合原料轉化[11-12]。近年來，隨著糧食產量的增加，我國水稻和小麥庫存量巨大，大量超期儲存糧亟待處理[13]。超期儲存小麥和水稻是長期（3年以上）儲藏的糧食，由于霉變、真菌毒素和重金屬超標等問題，一般用于燃料乙醇的生產[14-15]。小麥和水稻原料的利用，能夠實現原料多元化的柔性生產，避免企業過度依賴玉米原料，有效緩解原料供應緊張的問題[16]，形成多種原料替代格局，增強企業活力和市場競爭能力，促進企業的長足、健康發展[17]。由于超標的小麥和水稻價格較低，通過優化處理等方式，能夠降低企業生產成本，取得較好的經濟效益，還能保證糧食安全[18]。

目前，燃料乙醇的研究熱點主要聚焦在如何利用超期儲存小麥、水稻等多種原料發酵生產燃料乙醇。劉勁松等[19]研究了脫殼水稻粉與玉米粉混合發酵，并對于發酵醪進行高效液相色譜（highperformanceliquidchromatography，HPLC）分析，篩選出超期儲存水稻添加比例40%時，淀粉出酒率最高。沈存忠等[20]研究了超期儲存水稻脫殼率對于燃料乙醇生產的影響，發現將稻谷進行一定程度脫殼生產，有利于生產穩定進行且降低生產成本。孫振江等[21]對于以小麥為原料進行酒精發酵研究，優化了適用于小麥發酵的固形物含量、液化時間和酶加量。其他相關的研究還有很多，這些研究也為燃料乙醇生產提供了指導。基于以上的情況，結合酒精工廠現有生產工藝情況，該研究以耐高溫酒用干酵母為發酵菌株，采用同步糖化發酵法，通過測定液化醪和發酵醪指標，優化了超期儲存小麥和水稻混合發酵的輔料，為復合原料生產燃料乙醇提供參考價值。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

超強復配淀粉酶（13萬U/g）、低pH淀粉酶（14萬U/g）：諾維信（中國）生物技術有限公司；耐高溫淀粉酶（18萬U/g）、糖化酶（26萬U/g）、酸性蛋白酶（10萬U/g）：山東隆科特酶制劑有限公司；α-淀粉酶（14萬U/g）：杰能科（中國）生物工程有限公司；蔚藍木聚糖酶（3萬U/g）、夏盛木聚糖酶（3萬U/g）、挑戰定制酶（5萬U/g）分別為青島蔚藍生物股份有限公司、夏盛（北京）生物技術有限公司、北京挑戰生物技術有限公司惠贈；耐高溫酒用干酵母：安琪酵母股份有限公司；安菌泰殺菌劑：柳州龍泰科技有限公司；色譜標品均為色譜純，其他試劑均為分析純；超期儲存水稻和小麥取自廣西中糧生物質能源企業車間。

1.2 儀器與設備

ZHWY-2112F搖床：上海智城分析儀器制造公司；安捷倫1200型液相色譜：安捷倫科技公司；3-18K離心機：美國Sigma公司；KQ-800KDV超聲清洗機：江蘇省昆山超聲儀器公司；WELCH 2546C-02真空泵：美國威爾奇公司；AL204分析天平：瑞士Mettler公司；DSH-50-10快速水分測定儀：上海越平科學儀器有限公司；NDJ-5S黏度計：上海精密儀器有限公司；液化罐、蒸餾冷凝裝置：河南神泰公司定制；HWS-28水浴鍋：上海一恒科學儀器有限公司；PHSJ-3F pH計：上海雷磁儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 燃料乙醇生產工藝流程及操作要點

操作要點：

小麥和水稻粉碎后均過20目篩網，按一定比例混合，加入保溫70 ℃的混合水（清液∶工藝水∶中水比例為34∶51∶15），控制粉漿干物質含量30%左右，調節pH5.6，添加α-淀粉酶0.17 kg/t糧，進行拌料30 min。然后將溫度升至90 ℃，液化120 min，整個液糖化和發酵流程具體參考文獻[21]。

將液化醪降溫至32 ℃，硫酸調節pH至4.2～4.4，裝液量200 mL/500 mL，發利耐高溫酒用干酵母接種量0.05%，糖化酶加量0.68 kg/t糧，酸性蛋白酶加量0.035 kg/t糧，安菌泰5 mg/L，轉速100 r/min，發酵時間72 h。

發酵完成后，取100 mL成熟醪，加入100 mL去離子水，混合均勻后用蒸餾冷凝裝置蒸酒；蒸酒后剩余的殘液直接用板框布過濾，計算5 min內的過濾速率；濾液用快速水分測定儀測定干物含量。

1.3.2 檢測方法

（1）理化指標的測定

粗脂肪按國標GB 5009.6—2016《食品中脂肪的測定》[22]測定；粗蛋白按國標GB 5009.5—2010《食品中蛋白質的測定》方法測定[23]；半纖維素和纖維素參考文獻測定[24]；灰分按國標GB 5009.4—2016《食品中灰分的測定》[25]測定；淀粉按國標GB/T 5009.9—2008《食品中淀粉的測定》[26]方法測定；還原糖的檢測：按國標GB/T 5009.7—2008《食品中還原糖的測定》[27]測定；干物質的檢測：使用快速水分測定儀測定；黏度：使用黏度測定儀測定；酒精度：酒精計法。

（2）DE值和淀粉出酒率的計算

葡萄糖當量（dextrose equivalent）值及淀粉出酒率的計算公式如下：

（3）發酵醪組成的測定

采用高效液相色譜法進行測定，色譜柱：HPX-87H（300 mm×7.8 mm）；流動相：0.005 mol/L H2SO4；泵流速：0.6 mL/min；柱溫：65 ℃；示差折光檢測器，設置溫度：50 ℃；進樣量20 μL；運行時間30 min。

1.3.3 試驗優化

小麥添加比例優化實驗：拌料階段將小麥分別按0%、30%、50%和100%添加至水稻中，其余步驟與1.3.1一致，測定各組指標。

不同種類淀粉酶的篩選實驗：將小麥按30%比例與水稻混合，以淀粉酶活性一致進行添加，設置4組實驗，拌料階段分別添加超強復配淀粉酶（0.26 kg/t糧）、隆大耐高溫淀粉酶（0.21 kg/t糧）、低pH淀粉酶（0.26 kg/t糧）和杰能科α-淀粉酶（0.17 kg/t糧，對照），其余步驟與1.3.1一致，測定各組指標。

降黏酶種類及添加方式的篩選實驗：將小麥按30%比例與水稻混合，根據降黏酶的耐溫特性，設置4組實驗，分別在拌料階段額外添加蔚藍木聚糖酶、夏盛木聚糖酶，同步糖化發酵階段額外添加夏盛木聚糖酶、挑戰定制酶，各組酶添加量均為0.3 kg/t糧，其余步驟與1.3.1一致，對照組為不添加降黏酶的實驗，測定各組指標。

1.3.4 數據處理

實驗數據均以均值表示，采用Excel 2010作圖。

2 結果與分析

2.1 原料成分分析

將超期儲存的小麥和水稻進行全組分分析，結果如表1所示，從粗脂肪和灰分含量來看，小麥中的兩種成分含量均低于水稻，更利于發酵時的原料利用。從淀粉含量來看，小麥中的淀粉含量要比水稻中的高出約6個百分點，添加小麥更有利于發酵酒精度的提高。此外，小麥的粗蛋白和半纖維素含量分別是水稻的1.8和1.7倍，在液化發酵時會導致醪液的黏度較大，泡沫多，裝料系數小[28]。因此，需要摸索小麥的最佳添加比例，在提高混合原料的淀粉含量的同時，醪液黏度也在可接受范圍內，減少設備的處理壓力。

表1 超期儲存小麥和水稻原料的全組分分析Table1 Total component analysis of aging wheat and rice raw materials%

2.2 小麥添加比例優化實驗

小麥中的蛋白和可溶性戊聚糖是小麥醪液黏度高的主要原因[28]，當小麥與水稻摻混使用時，醪液濃度也會因高黏度受到限制，因此需要摸索小麥的添加比例。本實驗設計了不同的小麥添加比例對液化醪進行黏度、還原糖和干物等指標的影響，結果見表2。

由表2可知，在同一拌料干物下，隨著小麥添加比例的升高，液化醪的黏度明顯升高，液化干物也隨之提高。這可能是小麥中麩皮的存在，導致混合原料整體吸水性增強[29]，使得干物含量升高，從而導致液化后醪液的黏度有大幅升高。醪液黏度升高在生產上會導致管道的堵塞和壓力升高，不利于生產設備的連續運行[30]。基于工廠設備管道對于醪液黏度的承受范圍，陳化小麥添加30%是可以接受的。對不同小麥添加比例的成熟醪進行高效液相色譜HPLC分析，結果見表3。

表3 不同小麥添加比例對成熟醪指標的影響Table3 Effect of different wheat addition ratios on indexes of mature mash

由表3可知，隨著小麥添加比例的升高，殘糖（DP4+、麥芽三糖、麥芽糖、葡萄糖和果糖）、副產物（如甘油和乙酸）等有所升高，成熟醪黏度在小麥添加比例在50%及以上時黏度升高較明顯。

乙醇/甘油是反映發酵質量的重要指標[31]，其值越高說明發酵水平越高，需控制在一定范圍內。當小麥添加比例高于30%時，此值明顯下降。這說明小麥添加比例超過一定范圍時，會導致酵母發酵生產酒精的性能下降，產生更多的副產物—甘油等。淀粉出酒率是乙醇質量（以95%vol計）與原料中淀粉含量的比值[31]，由于兩種原料按不同比例混合時的淀粉含量差異較大，以淀粉出酒率表征發酵效率較為準確。結果顯示，當小麥添加比例0和30%時，淀粉出酒率最高，均為53%。

結合液化醪及成熟醪分析結果，綜合考慮，30%小麥的添加比例比較合理，對于生產穩定性影響較小，且提高了乙醇產量。

2.3 不同種類淀粉酶的篩選實驗

耐高溫淀粉酶可以快速將長鏈淀粉切割成長短不一的糊精，因此具有明顯的降黏效果[32]。不同廠家的耐高溫淀粉酶來源有所差異，對于同一種底物的降解效果也會不同。針對優化出的30%小麥添加比例的混合原料，主要考察淀粉酶對于液化醪黏度及發酵效果的影響，結果見圖1。

由圖1可知，從液化醪黏度來看，超強復配淀粉酶對于液化醪的降黏效果最佳，液化醪黏度為372 mPa·s，其次是杰能科α-淀粉酶。從發酵酒精度來看，使用超強復配淀粉酶的酒精度最高為12.37%vol，其余三種淀粉酶釀造的酒精度約為11.38%vol，約高出1個百分點。這可能與超強復配淀粉酶中復配了耐高溫的蛋白酶有關。由于小麥原料中蛋白含量較高（表1），影響著液化醪液的黏度，而超強復配淀粉酶中的蛋白酶可以較好的發揮作用，緩解了小麥添加帶來的黏度升高。由于小麥蛋白的降解，可能使得混合原料的淀粉釋放更徹底，從而導致酒精度的升高。因此，針對添加30%陳化小麥的混合原料，使用超強復配淀粉酶更適合。

圖1 不同種類淀粉酶對液化和發酵的影響Fig.1 Effect of different amylases on liquefaction and fermentation

2.4 降黏酶種類及添加方式的篩選實驗

小麥麩皮中含有較高的非淀粉多糖，在水溶液中形成黏度較高的膠體溶液，導致添加小麥后醪液黏度升高，最終導致清液干物的升高，增大了后期污水處理的壓力。降黏酶含一系列能夠對非淀粉多糖（纖維素、半纖維素、木聚糖和β-葡聚糖）進行轉化和分解的酶[33]。采用降黏酶來水解非淀粉多糖[34]，可以降低小麥預處理過程中的黏度[26]，從而提高初始拌料干物和后續發酵酒精度。根據不同酶的酶學特性，設計不同降黏酶種類及添加方式的降黏效果對比見圖2。

圖2 不同降黏酶種類及添加方式的降黏效果Fig.2 Viscosity lowering effect of different types and adding ways of viscosity lowering enzyme

首先，從降黏酶的添加方式來看，在拌料階段添加降黏酶可以顯著將液化醪黏度從449 mPa·s降低至140 mPa·s左右，并且發酵醪黏度也出現明顯下降；相比之下，在發酵階段添加降黏酶只能降低發酵醪黏度，并不能解決前期液化醪黏度高的問題。對于蒸酒后的殘液進行濾速和濾后干物分析，發現不管何種降黏酶和添加方式，均能不同程度的提高殘液的濾速（以5 min內的過濾速率計），在拌料階段添加蔚藍木聚糖酶的濾速最高，由對照（不添加降黏酶）的4.8 mL/min提高至7.8 mL/min；最終濾過的清液干物也由對照的8.2%降低至5.7%。這可能是由于小麥麩皮中半纖維素含量較高（表1），降黏酶尤其是木聚糖酶的添加促進了小麥麩皮的部分降解，使得大分子的非淀粉多糖降解成長短不一的小分子，從而導致表觀黏度下降，蒸餾殘液過濾速度快。因此，結合黏度、濾速及清液干物結果分析，降黏酶在拌料階段添加效果最佳，最優的降黏酶是蔚藍木聚糖酶，參考工廠中降黏酶的添加量，選擇添加量為0.3 kg/t糧。

3 結論

該文通過搖瓶發酵小試實驗，優化了超期儲存小麥和水稻混合發酵生產燃料乙醇的發酵輔料。在兩者混合發酵生產乙醇時，干物質含量為30%，小麥添加比例30%，使用超強復配淀粉酶的條件下，液化醪黏度最低（約370 mPa·s），酒精度最高可達12.37%vol。若在拌料階段額外添加0.3 kg/t糧的蔚藍木聚糖酶，可顯著降低液化醪和發酵醪黏度，蒸餾殘液濾速（以5 min內過濾速率計）由4.8 mL/min提高至7.8 mL/min，清液干物由8.2%降低至5.7%，從而有效的減輕后期污水處理壓力。這為更多元谷物的生產優化提供一定的指導思路。