嗜酸乳桿菌發酵棗汁的非靶向代謝組學研究

王 彤，劉慧燕，潘 琳，胡明珍，李旭陽，馬 妮，方海田

（寧夏大學 食品與葡萄酒學院 寧夏食品微生物應用技術與安全控制重點實驗室，寧夏 銀川 750021）

紅棗（Ziziphus jujubaMill.）是李科棗屬植物，棗果原產自中國[1]。紅棗中含有豐富的有機酸、氨基酸[2]、維生素、礦物質和微量元素，以及大量的多糖、總酚、總黃酮類化合物[3]、環磷酸腺苷[4]、皂苷[5]等，具有抗衰老、抗腫瘤、護肝等的作用[6]。而紅棗含糖量較高，并不適宜低糖人群食用，因此利用技術手段降低紅棗含糖量就成為新的研究趨勢。乳酸菌具有維持胃腸道菌群平衡、調節消化免疫系統、調節血糖等作用。采用乳酸菌發酵果汁可降低單糖含量，豐富產品口感，防止腐敗，生成新的營養物質，從而提高保健價值[7]。余偲等[8]利用乳酸菌產γ-氨基丁酸的特點，生產出一種具有功能性成分的紅棗乳酸菌飲品；周春峰等[9]利用復合乳酸菌發酵紅棗，減少了自由基，提高了抗氧化活性。

代謝組學是以生物樣品中的低分子質量代謝產物（如有機酸、脂肪酸、氨基酸、糖等）為研究對象，通過高通量檢測和數據處理，進行信息整合及生物標記物鑒定的科學[10]，由于氣相色譜-質譜（gas chromatography-mass spec trometry，GC-MS）技術成本較低，具有重復性好、分辨率高、基體效應小的優點[11]，已被廣泛用于發酵食品中代謝物的定性和定量測定。如陳中等[12]利用嗜酸乳桿菌（Lactobacillus acidophilus）和植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）發酵西瓜汁，利用GC-MS技術測定主要揮發性物質，對比了不同乳酸菌發酵特性的差異；楊立啟[13]采用GC-MS法比較了植物乳桿菌、嗜酸乳桿菌和副干酪乳桿菌發酵蜜桔的揮發性成分差異，以及三種乳酸菌對呈香呈味方面的作用。上述研究均表明基于氣相色譜-質譜聯用的代謝物分析有助于了解發酵產品的代謝物差異。

然而，目前關于發酵棗汁的報道主要集中經過發酵后風味物質變化，對發酵過程中代謝產物的差異以及動態變化的研究較少，本研究采用GC-MS結合多元統計分析方法，對發酵紅棗汁在不同發酵階段差異代謝物進行全面的鑒定與分析，以期深入了解發酵過程中風味形成、營養物質產生的潛在機制，為紅棗乳酸菌發酵產品的功能性研發及其產業化發展提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

干紅棗（Ziziphus jujube）：寧夏同心路市場采購；嗜酸乳桿菌（Lactobacillus acidophilus）：寧夏固原農家采集漿水，無菌離心管采樣帶回實驗室，放于實驗室4 ℃保存。

1.1.2 化學試劑

氯仿（色譜純）：北京沃凱生物科技有限公司；吡啶（色譜純）、甲氧胺鹽酸鹽（分析純）、L-2氯苯丙氨酸（分析純）：上海阿達瑪斯試劑有限公司；雙三甲基硅烷基三氟乙酰胺（bistrimethylsilane trifluoroacetamide，BSTFA）（1%三甲基氯硅烷（trimethylchlorosilane，TMCS））硅烷化試劑：美國Regis公司；甲醇、乙腈（均為色譜純）：美國Fisher Scientific公司；果膠酶（500 U/mg）：上海源葉生物有限公司。

1.1.3 培養基

MRS肉湯培養基：青島高科技工業園海博生物技術有限公司。

1.2 儀器與設備

BXM-30R立式壓力蒸汽滅菌器：上海博訊實業有限公司；LRH-250生化培養箱：廣東省醫療器械廠；Y66靜音真空高速破壁機：九陽股份有限公司；Wonbio-96c多樣品冷凍研磨儀：上海萬柏生物科技有限公司；NewClassicMFMS105DU New Classic MS電子天平：瑞士METTLER TOLEDO公司；Centrifuge 5424 R高速冷凍離心機、（100～1 000）μL、（20～200）μL手動單道移液器：德國Eppendorf公司；JXDC-20氮吹儀：上海凈信實業發展有限公司；8890B-5977B氣相色譜-質譜聯用儀：美國Agilent公司；TH2-D恒溫振蕩器：上海葉拓儀器儀表有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株活化

將嗜酸乳桿菌在MRS固體培養基上進行劃線后放入恒溫培養箱，37 ℃條件下培養24 h，挑取固體培養基上的單菌落轉接到MRS液體培養基中，經過兩次MRS液體培養基繼代培養進行擴培。

1.3.2 發酵棗汁的制備

將干紅棗清洗干凈、去核、切塊，將清洗后的紅棗按料液比1∶6（g∶mL）加水，在90 ℃條件下預煮20 min可使紅棗充分軟化，冷卻到室溫后，打漿機破碎，加入0.15%果膠酶，裝入已滅菌的錐形瓶，進行巴氏殺菌，根據單因素響應面優化的發酵條件，按4%（V/V）接種量接入事先活化好的嗜酸乳桿菌，37 ℃條件下恒溫培養12 h。將上述發酵汁放置-80 ℃，備用[14]。

1.3.3 發酵棗汁預處理

稱取50 mg發酵棗汁樣本，放入1.5 mL EP管中，加入40 μL內標（L-2-氯-苯丙氨酸0.3 mg/mL），加入360 μL冷甲醇，勻漿，冰水浴中超聲提取30 min，加入200 μL的氯仿和400 μL的純水，渦旋1 min，冰水浴中超聲提取30 min，10 000 r/min、4 ℃條件下離心10 min，取400 μL上清液，室溫揮干后衍生化。

1.3.4 不同發酵階段棗汁中揮發性化合物分析

采用氣相色譜質譜（GC-MS）聯用儀對發酵棗汁進行代謝組學分析。

分別設置0 h（記為FJ-0 h）、18 h（記為FJ-18 h）、22 h（記為FJ-22 h）的不同發酵時間，并設置未發酵組（記為UFJ）及質控樣品組（記為QC），每組樣品采樣5次，全部上機進行分析。

氣相色譜條件：HP-5MS（5%-苯基）-甲基聚硅氧烷毛細管柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；進樣量1 μL；不分流進樣；載氣：高純氦氣（He）；流速1.0 mL/min；進樣口溫度260 ℃；程序升溫：初始溫度60 ℃，8 ℃/min 的速度升至310 ℃，并維持6 min。

質譜條件：電離方式為電子電離（electron ionization，EI）源；離子源溫度230 ℃；四極桿溫度150 ℃，電子能量70 eV；掃描類型：全掃描模式。

1.3.5 代謝物定性定量分析

GC-MS的原始數據經MassHunter軟件進行預處理，導出CSV格式的三維數據矩陣，三維矩陣包括的信息有：樣品信息、代謝物名稱和質譜響應強度，內標峰以及任何已知的假陽性峰（包括噪音、柱流失和衍生物化試劑峰）均從數據矩陣中去除，并進行去冗余和峰合并。用峰面積歸一化法對樣本質譜峰的響應強度進行歸一化，得到歸一化后的數據矩陣。采用MassHunter workstation Quantitative Analysis（v10.0.707.0）軟件進行代謝物注釋、數據預處理等，最終得到代謝物列表及數據矩陣，結合T檢驗和正交偏最小二乘法-判別分析（orthogonal-partial least squares-discriminant analysis，O-PLS-DA）篩選出代謝物。進一步采用通路分析、關聯分析、聚類分析等高級分析對代謝的生物學信息進行挖掘。

1.3.6 數據處理

篩選出的顯著性代謝差異物根據其質荷比、保留時間（retention time，RT）和二級碎片信息通過Progenesis QI軟件在HMDB（http：//www.hmdb.ca/），ECMDB（http：//ecmdb.ca/），YMDB（http：//www.ymdb.ca/）與KEGG（http：//www.kegg.jp/），Chem-spider（http：//www.chemspider.com/）等數據庫進行檢索，確定其結構。

2 結果與分析

2.1 多元統計分析

主成分分析（principal component analysis，PCA）得分圖的聚散程度反映了樣本代謝物的相近程度，即發酵過程中代謝物的聚類情況，代謝水平越接近的點在得分圖上越接近[15]。將未發酵棗汁、嗜酸乳桿菌發酵棗汁0 h、18 h、22 h進行PCA，結果見圖1。由圖1可知，樣品PCA中模型對X變量差異解釋能力R2為0.651＞0.5，表明模型的擬合準確性好，且得分圖的所有樣品均在橢圓內，說明分析的樣品中沒有異常值。隨著發酵時間的延長，由于代謝物之間的相互作用，產生酸等各種風味物質，導致未發酵、0 h和18 h樣本之間存在明顯分離。而發酵18 h和22 h后的樣本在得分圖上區分不明顯，可能是原料中的糖基本被消耗，代謝物變化緩慢。

圖1 不同發酵階段代謝物主成分分析結果Fig.1 Results of principle component analysis for metabolites in different fermentation stages

2.2 嗜酸乳桿菌發酵棗汁過程中揮發性成分O-PLS-DA結果

對嗜酸乳桿菌發酵棗汁過程中的揮發性成分進行主成分分析和聚類分析，可將發酵分為四個階段：未發酵、0 h、18 h、22 h。因此將發酵過程中的樣品進行歸類，利用O-PLS-DA進行分析，可以得出發酵棗汁各階段的主要呈味香氣成分，不同發酵時間O-PLS-DA得分結果見圖2。由圖2可以看出，此模型共提取4個預測成分，這4個預測成分的累計統計量所建模型對X矩陣的解釋能力R2為0.788，說明該模型對揮發性成分矩陣的解釋能力R2為0.788；所建模型對Y矩陣的解釋能力R2為0.998，說明該模型對發酵過程中樣品矩陣的解釋能力R2為0.998；模型的預測能力Q2為0.978。通常R2和Q2＞0.50擬合準確性較好，＞0.4即可接受，預測該模型在本實驗中的擬合準確性極高。

圖2 不同發酵階段代謝物正交偏最小二乘法-判別分析結果Fig.2 Results of orthogonal partial least squares-discriminant analysis for metabolites in different fermentation stages

2.3 差異代謝物篩選與分析

基于O-PLS-DA模型分析結果，將P值＜0.05的代謝物作為后發酵階段的差異代謝物，結果共鑒定出29種顯著差異代謝物。其中有機酸4種，苯環化合物3種，酯類物質2種，有機雜環化合物2種，碳氧化合物1種，其他種類化合物15種。不同發酵階段差異代謝物含量如表1所示。

表1 棗汁不同發酵階段差異代謝物Table1 Different metabolites of jujube juice in different fermentation stages

續表

差異代謝物在不同階段相對豐度變化的聚類分析見圖3，左側為代謝物聚類的樹狀圖，右側為代謝物的名稱，同一代謝物在不同時間段，藍色表示表達量降低，紅色表示表達量升高。由圖3可知，隨著發酵時長增長，代謝物表達量逐漸增加，18 h和22 h代謝物表達相似。

圖3 棗汁不同發酵階段差異代謝物聚類分析Fig.3 Cluster analysis of differential metabolites of jujube juice in different fermentation stages

在發酵乳發酵過程中產生的酸類化合物主要來源于脂肪分解、蛋白質水解等代謝途徑[16]。有機酸在風味方面更顯較大。由圖3可知，通過嗜酸乳桿菌與紅棗協同發酵可產生更多具有酸敗氣味[17]的己酸，在發酵過程中己酸含量逐漸降低，說明通過嗜酸乳桿菌發酵可減弱不良氣味，有利于風味的提升。

風味物質方面，在發酵過程中，辛酸甲酯的含量由高降低，辛酸甲酯具有柑香與酒香味[18]。另外發現一種與3-苯乳酸類似的物質苯乙醛，它是一種具有濃郁玉簪花香氣的風味物質[19]，在發酵初期階段相對含量提高，賦予發酵產品獨特風味，它通過苯丙氨酸代謝途徑產生，苯丙氨酸代謝途徑與酚類化合物合成有關。對甲酚具有臭味，在發酵過程中含量下調。松油醇具有花香，是常見香料，經過發酵后，含量降低。1-辛烯-3-醇具有蘑菇、薰衣草、玫瑰和干草的香氣[20]，在發酵棗汁產品揮發性成分中常見，隨著發酵時間延長，相對豐度增加。1-十八烯是一種馬鈴薯苗所具有的揮發性物質，在發酵過程中代謝被抑制。這些香氣物質通過發酵在發酵產品所含濃度增加，促進了良好風味的形成。

氨基酸具有縮短發酵時間賦予了發酵產品更多的營養物質的作用[21]。雖然氨基酸并非發酵乳的揮發性風味物質，但作為揮發性化合物的前體物質，能夠進一步轉化成醇類、醛類、酯類和硫化物等物質，且對發酵產品的滋味具有的較大貢獻[22]。去甲纈氨酸、L-組氨酸在發酵過程中上調。肌氨酸在發酵過程中含量降低，與甘氨酸代謝有關。

2.4 關鍵代謝物分析

為了深入了解發酵棗汁發酵階段潛在代謝途徑，進行差異代謝物的代謝途徑分析，結果見圖4。由圖4可知，通路分析結果顯示共獲得26個途徑，基于重要性分析，對關鍵代謝途徑進行篩選，篩選出12條在嗜酸乳桿菌發酵紅棗過程重要的代謝通路，這些途徑包括：組氨酸代謝、苯乙烯降解、煙酸和煙酰胺代謝、精氨酸生物合成、甲苯降解、苯丙氨酸代謝、阿特拉津降解、嘌呤代謝、甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝、苯甲酸降解、精氨酸和脯氨酸代謝、嘧啶代謝。其中重要的代謝物分別為L-組氨酸、去甲纈氨酸、尿素、次黃嘌呤、褪黑素、煙酰胺。

圖4 棗汁不同發酵階段差異代謝物京都基因與基因組百科全書拓撲學分析氣泡圖Fig.4 Bubble chart of Kyoto encyclopedia of genes and genomes topological analysis of differential metabolites of jujube juice in different fermentation stages

L-組氨酸作為氨基酸代謝的重要產物，在紅棗發酵過程中參與了其中6條KEGG代謝通路，分別為β-丙氨酸代謝、組氨酸代謝、氨酰tRNA生物合成、植物次生代謝產物的生物合成、組氨酸和嘌呤生物堿的生物合成。其中重要的代謝物分別為L-組氨酸、去甲纈氨酸、尿素、次黃嘌呤。肌肽通過β-丙氨酸代謝生成L-組氨酸和β-丙氨酸，肌肽具有調節血糖的功效。在接菌后產生此代謝通路，猜測嗜酸乳桿菌可能通過分解乳酸菌中肌肽產生L-組氨酸。

去甲纈氨酸是一種非蛋白源性支鏈氨基酸，非蛋白質氨基酸在生物體內可參與儲能、形成跨膜離子通道和充當神經遞質，乳酸菌具有較強的精氨酸代謝能力，通過精氨酸脫亞胺途徑可產生尿素[23]。尿素作為代謝過程中的終產物，在發酵過程中注釋到8條KEGG代謝通路，包括精氨酸、脯氨酸、嘌呤、嘧啶、甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、苯丙氨酸代謝通路、阿特拉津降解。

次黃嘌呤氧化酶氧化次黃嘌呤生成黃嘌呤，進一步氧化黃嘌呤生成尿素。黃嘌呤氧化酶在催化多種不同底物的氧化時，除了生成產物尿酸之外，還形成超氧自由基和過氧化氫[24]。接菌0 h次黃嘌呤含量升高，尿素含量升高，黃嘌呤氧化酶含量增加，菌株自身可能具有產次黃嘌呤氧化酶的作用，隨著發酵時間增長，次黃嘌呤表達豐度降低，產生的代謝物對黃嘌呤氧化酶有抑制作用。

褪黑素是一種強氧化劑強，有超強的抗氧化清除能力，具有抗衰老、調節睡眠、抗腫瘤等作用。在參與色氨酸代謝過程中，4個連續酶促反應生成褪黑素。隨著發酵時間增長，棗汁中的pH降低。pH偏酸會提高褪黑素水平[25]。研究證明，褪黑素含量少，多酚、黃酮等抗氧化物質含量增加。YU Z等[26]研究發現，在甜櫻桃果實發育周期內，褪黑素含量與丙二醛含量呈現出反比的關系。乳酸菌具有提高多酚、黃酮物質等抗氧化物質含量的作用。為開發功能性發酵產品提供依據。

煙酰胺參與生物體內糖原分解、脂類代謝及各種物質的氧化作用[27]，是一種潛在抗氧化性物質，注釋到一條代謝通路為煙酸和煙酰胺代謝。隨著發酵時間增加，含量增加，說明通過嗜酸乳桿菌的發酵，抗氧化能力被逐漸提高。

3 結論

本研究采用GC-MS技術對嗜酸乳桿菌發酵紅棗汁各階段的代謝物進行分析。結果表明，在未發酵、發酵0 h、18 h、22 h這4個時間點中有12條代謝通路具有重要作用，其中篩選出關鍵代謝物為L-組氨酸、去甲纈氨酸、尿素、次黃嘌呤、褪黑素、煙酰胺。辛酸甲酯、苯乙醛、松油醇、1-辛烯-3-醇、1-十八烯作為呈香作用的酯類物質和醛類物質隨著發酵時間增加對乳酸菌飲料特殊風味形成發揮重要作用。煙酰胺、褪黑素等具有強抗氧化能力的物質，為產品功能性開發提供依據，去甲纈氨酸、L-組氨酸、肌氨酸、肌肽等有機酸、氨基酸、多肽類等生物活性物質的含量變化為益生菌飲料的生產提供一定的技術支撐和理論指導。