基于轉錄組學分析耐高糖釀酒酵母耐受脫氫乙酸鈉脅迫的分子機制

裴宇鵬，李 嘯，2 ，肖澤濤，談亞麗

（1.三峽大學 生物制藥學院 中國輕工業酵母功能重點實驗室，湖北 宜昌 443002；2.安琪酵母股份有限公司 湖北省酵母功能重點實驗室，湖北 宜昌 443003；3.安琪生物集團有限公司湖北省酵母功能重點實驗室，湖北 宜昌 443003）

耐高糖酵母是一種能夠在含高濃度糖的環境中進行生長、發酵產生乙醇和二氧化碳的真菌[1]，廣泛應用于烘焙等食品生產領域。脫氫乙酸鈉是一種常用于面包等食品的安全防腐劑，具有抑制霉菌等雜菌生長的作用，但是也會對酵母的增殖造成不利影響[2-3]。有關脫氫乙酸鈉的抑菌研究指出，首先脫氫乙酸鈉具有弱酸鹽類抑制劑通性，其水解產生的脫氫乙酸會穿過細胞的類脂膜，擾亂胞內pH致使細胞酶活性降低[4-5]；同時也會對細胞組分造成影響，如改變細胞膜的通透性和形態，還能引起線粒體損傷等[6-7]；其次還會影響細胞對物質的吸收與利用，如葡糖的攝取與氨基酸的合成[7]；最后抑制了細胞內的呼吸作用，使能量代謝紊亂[8-9]。然而，有關脫氫乙酸鈉的抑菌研究大多集中在細胞水平以及生理生化水平，缺乏分子水平的證據。

因此，本研究采用0.3 g/L脫氫乙酸鈉處理處于對數生長期的耐高糖釀酒酵母（Saccharomycescerevisiae）BH1，以未處理組為對照，通過核糖核酸測序（ribonucleic acidsequence，RNA-Seq）技術對其進行轉錄組測序及分析，并對差異表達基因（differentially expressed genes，DEGs）進行基因本體論（gene ontology，GO）與京都基因與基因組百科全書（kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）富集分析，并用實時熒光實時定量聚合酶鏈式反應（quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR）對結果進行了驗證，初步探究耐高糖釀酒酵母耐脫氫乙酸鈉的分子機制，為構建及優化耐脫氫乙酸鈉菌株提供科學依據和理論指導。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株

耐高糖釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）BH1：安琪酵母股份有限公司。

1.1.2 試劑

脫氫乙酸鈉（分析純）：上海麥克林生化科技有限公司；蔗糖（食品級）：廣西鳳糖制糖有限責任公司；酵母浸粉：安琪酵母股份有限公司；磷酸二氫鉀、七水硫酸鎂（均為分析純）：西隴化工股份有限公司；Total RNA Extractor提取試劑盒：生工生物工程（上海）股份有限公司；PrimeScriptTMRT-PCR試劑盒：寶生物工程（大連）有限公司；SYBR Green RT-PCR試劑盒：南京諾唯贊生物科技有限公司。

1.1.3 培養基

酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YEPD）培養基[10]：葡萄糖2%，酵母膏1%，蛋白胨1%；115 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。

分批發酵培養基[11]：蔗糖100 g/L，酵母浸粉20 g/L，KH2PO41g/L，MgSO4·7H2O1g/L；115℃高壓蒸汽滅菌20min。

1.2 儀器與設備

SP-752型紫外可見分光光度計：上海光譜儀器有限公司；FUS-50 L型全自動發酵罐：上海國強生化工程裝備有限公司；QYC-211型恒溫搖床：蘇州威爾實驗用品有限公司；HiSeq X Ten型高通量測序儀：美國Illumina公司；實時熒光定量PCR檢測系統：美國Bio-Rad公司。

1.3 方法

1.3.1 耐高糖釀酒酵母BH1種子液制備

將保藏于甘油管的耐高糖釀酒酵母BH1接入裝液量為20 mL/250 mL的YEPD培養基中，30 ℃、180 r/min條件下培養24 h。再將復壯后的菌液按10%（V/V）的接種量接入分批發酵培養基，30 ℃、180 r/min條件下培養12 h，作為種子液備用。

1.3.2 不同質量濃度的脫氫乙酸鈉對耐高糖釀酒酵母BH1生長的影響

將種子液按10%（V/V）的接種量接種于裝液量為45 mL/250 mL的分批發酵培養基，30 ℃、180 r/min條件下培養；在發酵4 h時，向發酵液中分別添加0、0.005 g、0.010 g、0.015 g、0.020 g和0.025 g脫氫乙酸鈉。培養過程中，每隔1 h取樣，采用紫外可見分光光度計在波長600 nm處測定菌液的OD600nm值，根據不同質量濃度的脫氫乙酸鈉對酵母生長的抑制情況來確定其合適的添加質量濃度。

1.3.3 脫氫乙酸鈉脅迫下耐高糖釀酒酵母BH1的發酵過程研究

將種子液按10%（V/V）的接種量接種于裝有18 L分批發酵培養基的50 L發酵罐中，于初始pH值4.8、溫度30 ℃、轉速200 r/min、罐壓0.035 MPa、通氣量40 L/min的條件下培養，在耐高糖酵母發酵對數期（4 h），向處理組（SD2G）加入脫氫乙酸鈉6 g，使發酵液中脫氫乙酸鈉的質量濃度達到0.3 g/L。對照組（CG）不添加脫氫乙酸鈉，兩組pH值維持在4.35，發酵12 h。每隔1 h取發酵液50 mL，發酵液稀釋到合適倍數后，采用紫外可見分光光度計在波長600 nm處測定菌液的OD600nm值。另外采用亞甲基藍染色法進行酵母活細胞計數，并計算出死亡率[12]。實驗重復3次，數據為3次的平均值。

1.3.4 脫氫乙酸鈉脅迫下酵母轉錄組數據測序及分析

在耐高糖釀酒酵母BH1發酵過程中，取發酵6 h時的對照組與處理組菌液1.5 mL，在液氮中速凍10 min，于-80 ℃保存備用，實驗重復3次，委托深圳華大基因進行轉錄組測序，測序所得的數據經質控后得到Clean reads，與釀酒酵母模式菌株S288c的基因組序列進行比對，然后進行基因和轉錄本定量分析、基于基因表達水平的各項分析，并對篩選出的樣品間差異表達基因進行GO功能顯著性富集分析、KEGG代謝通路顯著性富集分析等更深入的挖掘分析[13]。

1.3.5 實時熒光定量PCR驗證

采用PrimeScriptTMRT-PCR試劑盒對樣本核糖核酸（ribonucleic acid，RNA）進行反轉錄合成互補DNA（complementaryDNA，cDNA），進而采用實時熒光定量PCR檢測系統和SYBR Green RT-PCR試劑盒進行驗證實驗，所有實驗重復3次。內參基因β-actin[14]及轉錄組學數據中隨機挑選的10個差異表達基因的引物序列見表1。

表1 實時熒光定量PCR引物序列Table1 Sequences of real-time fluorescent quantitative PCR primers

續表

2 結果與分析

2.1 脫氫乙酸鈉對耐高糖釀酒酵母BH1生長的影響

不同質量濃度的脫氫乙酸鈉對耐高糖釀酒酵母BH1生長的影響見圖1。

圖1 不同質量濃度的脫氫乙酸鈉對耐高糖釀酒酵母BH1生長的影響Fig.1 Effect of different concentrations of sodium dehydroacetate on the growth of high-glucose resistant Saccharomyces cerevisiae BH1

由圖1可知，不同質量濃度的脫氫乙酸鈉對耐高糖釀酒酵母BH1的生長繁殖有不同程度的抑制作用，且質量濃度越高，抑制作用越強。為了獲得有較為明顯抑制效果的轉錄組學數據，本研究選擇質量濃度為0.3 g/L的脫氫乙酸鈉作為后續發酵罐實驗的處理條件。發酵罐實驗中，0.3 g/L脫氫乙酸鈉對耐高糖釀酒酵母BH1生長的影響見圖2和圖3。

圖2 50 L發酵罐中0.3 g/L脫氫乙酸鈉對耐高糖釀酒酵母BH1生長的影響Fig.2 Effect of 0.3 g/L sodium dehydroacetate on the growth of high-glucose resistant Saccharomyces cerevisiae BH1 in a 50 L fermenter

圖3 50 L發酵罐中0.3 g/L脫氫乙酸鈉處理后耐高糖釀酒酵母BH1的死亡率Fig.3 Mortality of high-glucose resistant Saccharomyces cerevisiae BH1 after 0.3 g/L sodium dehydroacetate treatment in 50 L fermentor

由圖2可知，在發酵前4 h，處理組與對照組中耐高糖釀酒酵母BH1的生長情況無顯著差異（P＞0.05），在第4小時向處理組添加0.3 g/L脫氫乙酸鈉后，耐高糖釀酒酵母BH1的生長速度明顯放緩，且生長至10 h時，其OD600nm值達到穩定。此時，二者的OD600nm值有顯著差異（P＜0.05）。

由圖3可知，處理組中添加0.3 g/L脫氫乙酸鈉后，耐高糖釀酒酵母BH1死亡率提高，但死亡率始終維持在10%以下，與對照組中酵母細胞的死亡率相差不大。綜上可知，添加0.3 g/L的脫氫乙酸鈉對耐高糖釀酒酵母BH1增殖具有明顯的抑制作用，但是其在一定程度上也能適應這種脅迫。

2.2 測序數據質控

測序數據的質量水平直接決定后續測序結果的準確性，對測序所得的原始數據進行質控，其結果見表2。

表2 測序數據統計結果Table2 Statistics results of sequencing data

由表2可知，處理組與對照組中質控后的數據其Q20值＞95%，Q30值＞90%，表明轉錄組測序結果良好，可用于后續分析。

2.3 差異表達基因篩選

對處理組（SD2G）和對照組（CG）的差異表達基因（DEGs）進行分析，篩選閾值設為：q值＜0.05且log2（差異表達倍數）＞1。結果共篩選出723個差異表達基因，其中上調基因253個，下調基因470個。由DEGs繪制的差異火山圖見圖4，其中橫坐標代表差異倍數值，縱坐標代表顯著性值。由圖4可知，處理組（SD2G）和對照組（CG）間存在一定量的差異表達基因，且部分基因的表達倍數較大，有利于后續的深入分析。

圖4 處理組與對照組耐高糖釀酒酵母BH1差異表達基因的火山圖Fig.4 Volcano plot of differentially expressed genes of high-glucose resistant Saccharomyces cerevisiae BH1 in treatment group and control group

2.4 差異表達基因功能富集和信號通路分析

GO數據庫（http：//www.gEneontology.org/）是基因功能數據庫，主要分為生物過程（biological process，BP）、細胞組成（cellular component，CC）和分子功能（molecular function，MF）[16]。差異表達基因的GO富集分析結果見圖5。

圖5 差異表達基因的基因本體論富集分析結果Fig.5 Results of gene ontology enrichment analysis of differentially expressed genes

由圖5可知，大多數DEGs主要富集到細胞質翻譯、核糖體、跨膜運輸、脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）的合成、氧化還原和鐵離子的穩態等過程。KEGG數據庫（http：//www.Genome.jp/kegg/）是有關基因通路的主要公共數據庫，主要分為細胞過程、環境信息處理、遺傳信息處理、代謝和有機系統[17]。差異表達基因的KEGG富集分析結果見圖6。由圖6可知，顯著富集通路涉及次級代謝產物的生成、核糖體、氨基酸的合成、碳代謝、二氧代羧酸代謝、氧化磷酸化、糖酵解、三羧酸循環（tricarboxylic acid cycle，TCA）、泛素蛋白水解和三磷酸腺苷結合盒（adenosine triphosphate binding cassette，ABC）轉運體等。

圖6 差異表達基因的京都基因與基因組百科全書富集分析結果Fig.6 Results of Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes enrichment analysis of differentially expressed genes

2.5 脫氫乙酸鈉對酵母細胞代謝過程的影響

2.5.1 酵母胞內蛋白的合成與分解代謝

通過對DEGs進行KEGG富集分析，發現核糖體通路中所有DEGs下調表達，其中基因RPS22A與RPS12共同編碼核糖體40S亞基蛋白，是核糖體的重要組成部分[18]，而核糖體合成量的減少會抑制蛋白質的翻譯。另外在氨基酸的生物合成中有41個DEGs顯著下調表達，有10個DEGs富集到賴氨酸的生物合成途徑，其中包括共同編碼高檸檬酸合酶（homocitrate synthase，HCS）的基因LYS20和LYS21，該酶催化了第一步合成賴氨酸的反應[19]，同時編碼后續合成反應的催化酶的基因也下調表達，所以細胞內的賴氨酸合成量可能不足。ALMIEDA B等[20]研究發現，乙酸脅迫會引起釀酒酵母胞內的氨基酸饑餓，這與脫氫乙酸鈉的脅迫有相似之處。有大量的上調DEGs集中在泛素依賴的蛋白分解途徑，其中基因CUL3和HRT1共同參與編碼E3泛素連接酶復合物，該酶合成的增加能促進蛋白質的修復與折疊[21-22]。綜上所述，脫氫乙酸鈉可能引起了胞內氨基酸的缺乏和翻譯紊亂，以致細胞內的蛋白質無法正常合成。另外，酵母會加強泛素依賴的蛋白水解途徑以抵御脫氫乙酸鈉的脅迫。

2.5.2 酵母胞內能量代謝

由圖5可知，KEGG富集到了糖酵解、TCA和氧化磷酸化途徑，這些都與細胞內能量代謝緊密相連。其中，基因HXK1和PYK2都下調表達，它們分別編碼己糖激酶和丙酮酸激酶，這兩個酶是糖酵解反應的限速酶，其合成通量的減少意味著糖酵解反應受到抑制。TCA中除了編碼蘋果酸脫氫酶的基因MDH2和編碼檸檬酸縮合酶的基因CIT2上調表達外，其他10個DEGs均下調表達，所以整體來看TCA被抑制。氧化磷酸化中富集到的16個DEGs全部下調表達，例如基因SDH1、SDH2和SDH4共同編碼電子傳遞鏈上的琥珀脫氫酶（復合體Ⅱ）；基因CYC1用于調控細胞色素c的合成，而細胞色素c承擔復合體Ⅲ和Ⅳ之間電子傳遞的作用，這些基因的下調表達表明了脫氫乙酸鈉干擾線粒體中電子傳遞鏈的正常運作。值得注意的是線粒體中的下調DEGs編碼的酶大多含有鐵離子結合位點，因此推測，脫氫乙酸鈉可能消耗了細胞內鐵離子導致這些酶的合成減少，進而使得TCA與氧化磷酸化過程被抑制，最終酵母細胞難以產生和利用能量。ZHU X L等[23]研究表明天然藥物活性成分厚樸酚可能會絡合酵母細胞內的鐵離子從而引起TCA和呼吸鏈相關的基因的下調表達，這與本研究結果有相通之處。總體來說，脫氫乙酸鈉嚴重干擾了耐高糖釀酒酵母BH1細胞內的能量代謝，使其生長和繁殖受到抑制。

2.5.3 酵母胞內鐵離子穩態和ABC轉運體

在上調的DEGs里發現了一組與鐵離子穩態相關的基因，它們涉及了鐵元素的吸收、轉運及利用。其中基因FIT2和FIT3共同編碼糖基磷脂酰肌醇糖錨整合入細胞壁的甘露糖蛋白，可促進細胞對環境中鐵的吸收，還可能用于鐵元素的儲藏[24]；而基因LOS1編碼的Ran GTPase結合蛋白參與細胞膜上鐵的轉運[25]；基因SIT1與ARN1參與編碼鐵氧嘧啶B轉運蛋白和鐵載體蛋白，后者在脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）復制壓力下會大量合成并從質膜轉移到液泡[26-27]；有報道指出基因TIS11響應于鐵缺乏，使出芽的釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）會進行代謝重塑，以優化鐵的利用率[28]；最后基因ISU1編碼線粒體中的鐵結合蛋白是合成Fe/S蛋白簇中所必需的，而Fe/S蛋白是電子傳遞鏈上重要的電子載體[29]。此外，編碼ABC轉運體的基因Pdr5與Snq2在脫氫乙酸鈉脅迫下被誘導，兩者編碼的蛋白能協同將生物異源物質排出質膜[30-32]，因此推測酵母細胞可能通過上調ABC轉運體排出脫氫乙酸根離子。綜上分析，脫氫乙酸鈉可能引起了胞內的鐵缺乏，而酵母細胞試圖通過促進鐵吸收及轉運以維持細胞內鐵代謝平衡，以及通過ABC轉運體加速脫氫乙酸根離子的排出來共同抵御外界脅迫。

2.6 實時熒光定量PCR驗證結果

隨機選取10個顯著的DEGs進行qPCR驗證實驗，包括5個上調基因與5個下調基因，驗證結果見圖7。

圖7 實時熒光定量PCR驗證結果Fig.7 Results of real-time fluorescence quantitative PCR verification

由圖7可知，qPCR驗證結果與轉錄組測序結果中DEGs在表達幅度上有一定差異，但表達趨勢是一致的，說明轉錄組測序的結果是可信的。

3 結論

本研究初步探討了耐高糖酵母應對脫氫乙酸鈉脅迫的分子調節機制。采用0.3 g/L的脫氫乙酸鈉對處于對數生長期的耐高糖釀酒酵母BH1進行處理，以未處理組為對照，采用RNA-Seq技術對其進行轉錄組測序及分析。結果表明，與對照組相比，處理組有723個DEGs，其中上調基因253個，下調基因470個，通過GO與KEGG富集分析發現脫氫乙酸鈉會抑制耐高糖酵母中核糖體、氨基酸的合成、糖酵解、TCA和氧化磷酸化等途徑，進而導致胞內蛋白合成困難，能量攝取不足；耐高糖酵母也會上調泛素依賴性蛋白水解和ABC轉運體，將合成異常的蛋白水解以及將細胞內的脫氫乙酸根離子排出質膜，以抵御脫氫乙酸鈉對細胞代謝活動造成的破壞。另外，酵母細胞試圖通過上調眾多與鐵離子穩態相關的顯著DEGs（FIT2，FIT3，LOS1，SIT1，ARN1，TIS11，ISU1）來抵御脫氫乙酸鈉引起的胞內鐵缺乏。