加壓毛細管電色譜法分析果蔬汁飲品中8種農藥殘留

朱麗君

（蘭州職業技術學院 生物工程系，甘肅 蘭州 730070）

果蔬汁飲品是人們日常生活中重要的飲品，主要是以水果、蔬菜為原料制成[1]。由于很多水果和蔬菜在種植過程中易受到蟲害的干擾，所以要進行農藥噴灑進行除害，最常用的幾種農藥包括甲萘威、莠去津以及有機磷類，也會出現一些禁用農藥的使用[2-4]。所以水果和蔬菜中的農藥殘留一直是食品安全的監控重點，由水果和蔬菜制作而成的果蔬汁飲品也有必要進行此類農藥殘留的監控，以此來保障人民群眾的食品安全[5-6]。

目前農藥殘留的測定常用的是氣相色譜法，但是有部分農藥的化學性質具有熱不穩定性或者強極性，用此法分析有一定的難度[7-9]。高效液相色譜法也是分析農藥殘留的方法之一，主要分析一些不易氣化的農藥組分，具有可靠性高、檢測速度快的優點，但由于其柱效沒有氣相色譜高，因此在分離復雜組分時很難達到滿意的結果[10-12]。加壓毛細管電色譜（pressurized capillary electrochromatography，pCEC）是結合了高效液相色譜與毛細管電泳兩者優點的一種技術，具有高柱效、高選擇性、高分離度、快速分離的特點[13-15]。本研究嘗試將pCEC雙重分離機理與二極管陣列檢測器（diode array detector，DAD）的優點相結合，開發果蔬汁飲品中樂果、敵敵畏、克百威、甲萘威、莠去津、甲基對硫磷、馬拉硫磷、百菌清共8種農藥組分的分析檢測新方法，并對前處理方法進行優化，為快速檢測和監管果蔬汁飲品中多種農藥殘留提供技術保障和參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

果汁樣品：市售；樂果（純度99.9%）、敵敵畏（純度99.2%）、克百威（純度99.6%）、甲萘威（純度99.9%）、莠去津（純度99.9%）、甲基對硫磷（純度99.8%）、馬拉硫磷（純度99.9%）、百菌清（純度99.9%）標準品：國家標準物質中心。甲醇、乙腈（均為色譜純）：德國Merck公司。

1.2 儀器與設備

2100型加壓毛細管電色譜系統、U3000型二極管陣列檢測器：美國賽默飛公司。

1.3 方法

1.3.1 加壓毛細管電色譜法檢測條件

參考相關文獻[16-17]中相關的前處理條件，采用親水作用毛細管電色譜柱進行8種農藥組分的分離，色譜條件如下：EP-100-20/45-1.8-C18色譜柱（45 cm×20 cm）；流速0.06 mL/min；電壓-9 kV（色譜柱末端）；進樣量2 nL；分流比1∶450；柱溫30 ℃；流動相為乙腈∶5 mmol/L Tris-HCl（66∶34，V/V）。

1.3.2 色譜條件優化

（1）流動相體系中有機相、添加劑的種類及濃度、pH值對目標組分分離的影響

本實驗分別比較流動相體系中有機相的種類（甲醇、乙腈）、添加劑的種類及濃度（乙腈∶Tris-HCl緩沖體系、乙腈-磷酸鹽緩沖體系）以及不同pH值對8種農藥組分分離情況的影響。

（2）電壓強度對目標組分分離的影響

電壓是加壓毛細管電色譜分離的主要動力之一[18-19]，施加不同的電壓強度對目標組分的分離能力和分離速度會產生不同影響，試驗分別施加0、-3 kV、-6 kV、-9 kV負向電壓，考察8種農藥組分在不同電壓強度下的分離情況。

（3）檢測波長的選擇

影響二極管陣列檢測器靈敏度的關鍵參數一般是特征波長的選擇，較佳的特征波長會降低雜質峰對目標的影響，減少干擾，一般建立適當的二極管陣列檢測方法時，需對這此參數進行優化。

1.3.3 標準曲線的制作

分別準確稱取樂果、敵敵畏、克百威、甲萘威、莠去津、甲基對硫磷、馬拉硫磷、百菌清標準品0.100 g，分別用甲醇定容于100 mL容量瓶中，搖勻，即制備得1.0 mg/mL的農藥標準儲備溶液，于4 ℃冰箱避光保存，備用。以各農藥組分標準品質量濃度（X）為橫坐標，各出峰面積（Y）為縱坐標，繪制標準曲線。

1.3.4 樣品前處理方法的優化

本實驗利用快速、簡單、經濟、高效、可靠、安全（Quick、Easy、Cheap、Effective、Rugged、Safe，QuEChERS）凈化技術對果蔬汁樣品進行前處理，由于針對多組分農藥的特異性，需進行提取溶劑和凈化劑的優化，才能最大程度提高目標組分的回收率。提取溶劑分別為甲醇、乙腈以及含1.0%氨水的乙腈共3種，凈化劑分別為C18、強陰離子交換劑（strong anion exchange，SAX）、石墨化炭黑（graphitized carbonblack，GCB）、N-丙基硅烷（N-propylsilane，PSA）共4種。

2 結果與分析

2.1 色譜條件的優化

2.1.1 流動相中有機相對目標組分色譜行為的影響

在流動相體系有機相（甲醇、乙腈）的選擇中，發現乙腈作為有機相時，可以縮短各目標組分的出峰時間。同時隨著流動相中乙腈所占比例的升高，各目標組分的保留時間進一步縮短，這主要是由于增加乙腈在流動相中所占的體積分數，使得電滲流作用增大，從而縮短了分析時間，但是隨著乙腈比例的增加，各目標組分之間的分離度隨之下降。當乙腈在流動相中的比例達到66%時，各目標組分的峰形較好，各組分之間均達到基線分離。

2.1.2 流動相中添加劑的種類及濃度對目標組分色譜行為的影響

實驗結果發現兩種流動相體系中乙腈-磷酸鹽緩沖體系含有的PO43-對體系的電滲流影響較大。在相同電壓強度下，乙腈-磷酸鹽緩沖體系比乙腈∶Tris-HCl緩沖體系更容易使柱子干涸，產生氣泡，因此選擇乙腈∶Tris-HCl體系作為流動相。在乙腈∶Tris-HCl緩沖體系中，當Tris-HCl的濃度從5 mmol/L增加到10 mmol/L時，各目標組分的出峰時間延長，這是由于電滲流隨著電解質濃度的增加而降低，且隨著緩沖液溶液濃度的增加，電滲流的焦耳熱效應也增大。相比之下，Tris-HCl在體系中的濃度為5 mmol/L時保留時間和分離度均較好。因此，選擇Tris-HCl緩沖溶液的濃度為5 mmol/L。

2.1.3 流動相pH值對目標組分色譜行為的影響

本研究中8種農藥組分在中性或者弱酸性溶液中化學性質較穩定，在堿性溶液中易水解。所以試驗分別比較了Tris-HCl緩沖溶液pH值為5.0、6.0、7.0時，對8種農藥組分的影響。結果發現，當Tris-HCl緩沖溶液的pH值為5.0或者6.0時，8種農藥組分的出峰時間均比pH值7.0時延后。因此，選擇pH值7.0的緩沖液體系。

2.2 電壓強度的選擇

本實驗中，在上述條件下8種農藥的分離情況良好，因此實驗僅考察pCEC施加電壓對樣品分離速度的影響，分別考察了分別施加為0、-3 kV、-6 kV、-9 kV負向電壓時，8種農藥的分離速度情況，結果見圖1。

圖1 電壓強度對分離速度的影響Fig.1 Effect of voltage intensity on separation speed

由圖1可知，隨著負向電壓升高，在電滲流的推動下8種農藥的分離速度明顯加快，同時色譜峰形變窄；當施加電壓為-9 kV時，樣品分離時間加快到16 min左右，甲基對硫磷、馬拉硫磷和百菌清的保留時間明顯提前，并且8種農藥組分完全分離。

2.3 檢測波長的選擇

pCEC實驗中檢測器采用的是二極管陣列檢測器，由于8種農藥組分的化學結構不同，需對各組分的標準溶液進行全波長掃描，根據各個組分的全波長掃描選擇較合適的吸收波長。實驗結果顯示：除甲基對硫磷在波長280 nm處有最大吸收外，其他7種農藥組分的最大吸收波長均在波長220 nm左右。當波長設置為220 nm時，結果表明甲基對硫磷有吸收值，且吸收值較大。因此，選擇220 nm作為測定波長。

2.4 標準曲線的制作

在最優條件下，配制一系列不同濃度的8種農藥混合標準溶液，進行加壓毛細管電色譜分析，并繪制校準曲線。取最低濃度的標準品混合液，連續進樣6次，考察色譜保留時間及峰面積的相對標準偏差（relative standard deviation，RSD），以信噪比（S/N）=10計算定量限（limit of quantitation，LOQ），以S/N=3計算檢出限（limit of detection，LOD），結果見表1。由表1可知，各農藥組分標準曲線相關系數R2均＞0.99，表明8種目標組分在一定質量濃度范圍均具有良好的線性關系，檢出限（LOD）為0.03～3.70 μg/mL，定量限（LOQ）為0.1～11.2 μg/mL。

表1 8種組分的線性范圍、標準曲線、相關系數、檢出限與定量限Table1 Linear range,standard curve,correlation coefficient,detection limit and quantification limit of 8 components

2.5 樣品前處理方法的優化

2.5.1 提取溶劑的選擇

參考相關文獻[20-21]，農藥組分的提取溶劑一般采用乙腈、甲醇兩種。本實驗分別考察了甲醇、乙腈以及含1.0%氨水的乙腈3種提取溶劑對各農藥組分回收率的影響，結果見圖2。

圖2 提取溶劑對各農藥組分回收率的影響Fig.2 Effect of extraction solvent on the recovery of pesticide components

由圖2可知，乙腈比較甲醇而言，在果蔬汁基質樣品中各農藥組分的回收率要高，但總體上回收率仍較低。但是在乙腈中添加1.0%氨水后，8種農藥組分回收率均有所提升，加標回收率達80%以上。因此，選擇含1.0%氨水的乙腈作為提取溶劑。

2.5.2 凈化劑的優化

由于果蔬汁飲品中含有色素、有機酸、脂肪等物質，會對農藥組分的測定產生干擾，所以本實驗考察了C18、SAX、GCB、PSA共4種凈化劑對果蔬汁飲品中各農藥組分回收率的影響。結果見圖3。由圖3可知，以GCB作為凈化劑時，各農藥組分回收率可達90%以上。因此，選擇GCB作為凈化劑。

圖3 各農藥組分經不同凈化劑處理后的回收率比較Fig.3 Comparison of recoveries of pesticide components treated with different detergents

2.6 加標回收率實驗

在果蔬汁樣品中分別添加低、中、高3種不同質量濃度的標準品溶液，進行加標回收實驗，3次平行測定，結果見表2。

表2 方法的加標回收率實驗結果Table2 Results of standard addition recovery rate tests of method

續表

由表2可知，8種農藥的3個水平的加標回收率為84.4%～107%，表明本實驗所建立的方法準確度高，能夠滿足檢測實際樣品需要。

2.7 精密度實驗

本方法的精密度通過對低、中、高3種不同質量濃度的標準溶液連續5次的測定進行評價，測定結果見表3。

表3 方法的精密度實驗結果Table3 Precision tests results of method

續表

由表3可知，8種農藥的精密度實驗結果相對標準偏差（RSD）為2.0%～6.3%，表明本實驗所建立的方法具有良好的精密度。

2.8 實際樣品測定

按照上述實驗方法，分別測定在市場隨機抽取的20份果汁樣品，結果均未檢出8種目標農藥。這說明樣品中目標農藥殘留濃度均低于檢出限或者不含有，整體情況良好。本實驗對20份果汁樣品進行加標后處理再測定，由圖4可知，在較復雜基質存在的條件下，使用該方法處理樣品仍能得到較好的結果。

圖4 加標樣品與未檢出樣品經富集處理后的色譜圖Fig.4 Chromatograms of spiked and undetected samples after enrichment

3 結論

本實驗利用加壓毛細管電色譜-二極管陣列聯用法，通過對流動相中有機相的組成、流動相添加劑種類及濃度、流動相的pH值、電壓強度和檢測波長的優化，以及樣品提取溶劑、凈化劑的比較，建立了同時分離檢測果蔬汁飲品中樂果、敵敵畏、克百威、甲萘威、莠去津、甲基對硫磷、馬拉硫磷和百菌清8種農藥組分的親水作用電色譜法。結果表明，采用EP-100-20/45-1.8-C18親水作用毛細管電色譜柱，選擇pH值7.0的乙腈∶5 mmol/L Tris-HCl（66∶34，V/V）作為流動相，電壓強度為-9 kV，檢測波長為220 nm的條件下，8種農藥組分在一定質量濃度范圍（樂果4～100 μg/mL、敵敵畏10～200μg/mL、克百威2～50μg/mL、甲萘威0.2～50μg/mL、莠去津0.1～20 μg/mL、甲基對硫磷4～100 μg/mL、馬拉硫磷12～120 μg/mL、百菌清3～65 μg/mL）內的標準曲線均具有良好的線性關系。樣品以1.0%氨水的乙腈提取并經GCB凈化后，3個水平的加標回收率能達到84.4%～107%，精密度實驗結果的相對標準偏差為2.0%～6.3%，所建立的方法具有可靠的準確度和精密度，能準確快速有效地檢測果蔬汁飲品中的8種農藥組分的含量，可為果蔬汁飲品中多種農藥組分的分析和監控提供技術支持。