富含γ-氨基丁酸功能性乳酸菌飲品的配方及穩定性研究

林 楊，孫 建，顧美英，楚 敏，李 雪，唐琦勇，朱 靜，張志東*

（1.新疆農業科學院 微生物應用研究所 新疆特殊環境微生物實驗室，新疆 烏魯木齊 830091；2.新疆農業大學 食品科學與藥學學院，新疆 烏魯木齊 830052）

目前我國約有70%的人群正處于“亞健康”狀態，表現出睡眠紊亂、焦慮、記憶力下降、食欲不振等癥狀，多由神經緊張或精神壓力過大，體內缺乏γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA）所導致[1-2]。研究表明，GABA是動物體中樞神經系統中主要的抑制性神經遞質，具有鎮靜安神、調節血壓、改善睡眠、治療糖尿病及改善肝、腎臟功能[3]等多種生理功效，人體每天攝入30～100 mg純天然的GABA就能起到一定保健作用[4-5]。GABA在食品工業中的應用始于1986年，以日本茶飲料“Gabaron”為代表。隨著近年來GABA的多種生理功能陸續被揭開，富含GABA食品的開發已成為國內外研究熱點。目前，市場中常見產品有美國G'NITE公司的GABA睡眠軟糖、澳洲Swisse公司的GABA膠原蛋白液等。相比之下，我國有關GABA食品研發起步較晚，國家衛生部并于2009年將GABA列入新資源食品原料目錄[6]，因此，加快研發富含GABA相關食品和飲品，具有重要的研究和應用前景。

乳酸菌（lactic acid bacteria，LAB）是食品安全級微生物（generally recognized as safe，GRAS）[7]，具有維持腸道平衡、改善乳糖不耐癥及提高機體免疫力等特性[8]，常用于酸奶、奶酪等乳制品的生產加工[9]。其中，部分乳酸菌具有谷氨酸脫羧酶（glutamate decarboxylase，GAD）活性，能夠產生GABA，將二者結合可生產出富含GABA的乳制品[10]。如謝芳等[11]利用乳酸乳球菌研發出了具有鎮靜安神作用的GABA水牛乳酸奶；HAGI T等[12]利用乳酸乳球菌乳亞種01-7制備出降血壓的GABA發酵乳。目前，富含GABA的乳酸菌飲料多以鮮乳[13-14]、麥胚[15]、南瓜[16]、香蕉[17]、蘋果[18]、藜麥[19]、白刺果[20]、椰果[21]等為發酵基質，經產GABA乳酸菌發酵研制而成的發酵乳飲料中GABA含量約為0.1～1.2 g/L，普遍較低。

本研究利用分離自吉爾吉斯斯坦地區特色乳制品中的乳酸菌株戊糖乳桿菌（Lactiplantibacillus pentosus）Z6，通過一步發酵工藝得到富含GABA和豐富營養物的乳酸菌發酵飲料，通過與蜂蜜、碳酸鈣和阿斯巴甜等配方的調配，結合模糊數學模型對其感官品質進行評定，對其口感、品質和穩定性進行了綜合性評價，為富含GABA的功能性乳酸菌飲品的研發及產業化生產奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株

戊糖乳桿菌（Lactiplantibacillus pentosus）Z6，分離篩選自吉爾吉斯斯坦地區特色乳制品，由新疆微生物資源保藏管理中心提供。

1.1.2 化學試劑

瓊脂、羧甲基纖維素鈉（carboxy methyl cellulose-Na，CMC-Na）、黃原膠、碳酸鈣、阿斯巴甜（均為食品級）：上海源葉生物科技有限公司；蜂蜜：市售；蛋白胨、酵母粉、葡萄糖、磷酸氫二鉀、乙酸鈉、檸檬酸氫二胺、硫酸錳、硫酸鎂、鹽酸（均為分析純或生化試劑）：北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司。

1.1.3 培養基

MRS肉湯、MRS瓊脂培養基：北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司。

發酵培養基：蛋白胨10 g，酵母粉10 g，葡萄糖20 g，磷酸氫二鉀2 g，乙酸鈉5 g，檸檬酸氫二銨2 g，硫酸錳0.04 g，硫酸鎂0.2 g，純凈水1 000 mL，0.1 mol/L鹽酸調節至pH值5.7左右。121 ℃滅菌15 min。

1.2 儀器與設備

SW-CJ-1F超凈工作臺：蘇州安泰空氣技術有限公司；HVE-50自動高壓滅菌鍋：日本HIRAYAMA公司；UVZ2550紫外分光光度計：日本島津儀器公司；PLCD高速冷凍離心機：德國Sigma公司；PHSJ-3F pH計：上海儀電科學儀器有限公司；AR224CN電子天平：上海奧豪斯儀器有限公司；HYW-2112全溫度恒溫調速搖床：上海智城分析儀器制造有限公司。

1.3 方法

1.3.1 功能性乳酸菌飲品的加工工藝流程及操作要點

菌種活化→種子培養液制備→發酵飲料制備→調配→灌裝、封口→功能性乳酸菌飲品

操作要點：

菌種活化：將4 ℃斜面保藏的菌株Z6劃線于MRS瓊脂培養基上37 ℃培養1～2 d，得到活化的菌株Z6。

種子培養液制備：取上述活化菌株Z6轉接至MRS肉湯培養基中，裝液量為100 mL/200 mL，于37 ℃、160 r/min振蕩培養24 h，得到菌株Z6種子培養液。

發酵飲料制備：將上述種子培養液轉接至發酵培養基中，接種量4%（V/V），裝液量為200 mL/500 mL，于37 ℃、160 r/min振蕩培養，以發酵液中的GABA含量、乳酸菌活菌數及pH值趨于穩定為發酵終點，得到乳酸菌發酵飲料。

飲品調配：將蜂蜜、碳酸鈣、阿斯巴甜按照一定配比添加到乳酸菌發酵飲料中，輔以瓊脂、黃原膠、CMC-Na復合穩定劑進行均勻調配。

灌裝、封口：將調配好的飲品灌裝于經60Co-γ于30 kGy條件下輻射滅菌24 h后的瓶中并封口，得到功能性乳酸菌飲品。

1.3.2 功能性乳酸菌飲品配方優化

（1）單因素試驗

固定碳酸鈣添加量0.30%，阿斯巴甜添加量0.10%，考察蜂蜜添加量（3%、4%、5%、6%、7%）對感官品質的影響；選定蜂蜜添加量6%，阿斯巴甜添加量0.01%，考察碳酸鈣添加量（0.20%、0.25%、0.30%、0.35%、0.40%）對感官品質的影響；選定蜂蜜添加量6%，碳酸鈣添加量0.30%，考察阿斯巴甜添加量（0.005 0%、0.007 5%、0.010 0%、0.012 5%、0.015 0%）對感官品質的影響。

（2）正交試驗

在單因素試驗的基礎上，以蜂蜜添加量（A）、碳酸鈣添加量（B）、阿斯巴甜添加量（C）為變量，以感官評分為考察指標，采用L9（34）正交試驗設計，正交試驗因素與水平見表1。

表1 功能性乳酸菌飲品配方優化正交試驗因素與水平Table1 Factors and levels of orthogonal experiments for formula optimization of functional lactic acid bacteria beverage

1.3.3 感官評價

隨機挑選10名食品專業的老師及學生組成評定小組，采用不記名的方式，對飲料的色澤、氣味、口感和組織狀態[22]進行單獨打分，統計總分并計算平均分[23]，滿分10分，功能性乳酸菌飲品評定標準見表2。

表2 功能性乳酸菌飲品感官評價標準Table2 Sensory evaluation standards of functional lactic acid bacteria beverage

1.3.4 模糊數學綜合評價模型的建立[24]

對不同條件下乳酸菌飲品感官指標進行模糊數學綜合評價，并建立評價集。

評價對象集X，代表9組感官評價的乳酸菌飲品集合，X={X1，X2，X3，X4，X5，X6，X7，X8，X9}。Xj代表9組乳酸菌飲品的綜合評價，其中j=1，2，3···9。

評價因素集U={U1，U2，U3，U4}，即U={色澤，氣味，口感，組織狀態}。

評語集V={V1，V2，V3，V4}，代表每個因素的評語集合，即V={優，良，中，差}={10，8，5，2}。

權重集K={K1，K2，K3，K4}，由表1可知，K={0.2，0.3，0.3，0.2}。

1.3.5 穩定劑配比優化

（1）單因素試驗

以離心沉淀率和穩定效率為評價指標，固定黃原膠添加量0.10%、CMC-Na添加量0.10%，考察瓊脂添加量（0.05%、0.10%、0.15%、0.20%、0.25%）對穩定性的影響；固定瓊脂添加量0.10%、CMC-Na添加量0.10%，考察黃原膠添加量（0.05%、0.10%、0.15%、0.20%、0.25%）對穩定性的影響；固定瓊脂添加量0.10%、黃原膠添加量0.10%，考察CMC-Na添加量（0.05%、0.10%、0.15%、0.20%、0.25%）對穩定性的影響。

（2）正交試驗

在單因素試驗的基礎上，以瓊脂添加量、黃原膠添加量、CMC-Na添加量為變量，以離心沉淀率為評價指標，設計L9（34）正交試驗，穩定劑配比優化正交試驗因素與水平見表3。

表3 穩定劑配比優化正交試驗因素與水平Table3 Factors and levels of orthogonal tests for stabilizer ratio optimization

1.3.6 穩定性測定

以離心管取待測樣品30 mL，并測定樣品質量M0（g）后，以5 000 r/min離心15 min后取出，除去上清液，測殘余物的質量M（g）。每個樣品進行3次平行測定后取平均值。離心沉淀率計算公式如下[25]：

穩定效率的測定：取待測樣品于比色皿，在600 nm波長下測定其吸光度值A0；取一定量樣品，于5 000 r/min離心15 min，取其上清液在600 nm波長下測定其吸光度值A。每個樣品進行3次平行測定后取平均值。穩定效率計算公式如下[26]：

1.3.7 貯藏期飲品的成分變化

在最佳配方及最佳穩定劑配比條件下，制備功能性乳酸菌飲品，在不同貯藏時間（0 d、30 d、60 d、90 d），常溫儲藏溫度（20～25 ℃）條件下進行貯藏，取樣分別測定飲品中活菌數、pH值、GABA含量，同時測定雜菌總數、大腸菌群數量、致病菌以及霉菌、酵母數量，得到貯藏期間飲品的成分變化。每個樣品進行3次平行測定后取平均值。

1.3.8 分析檢測方法

乳酸菌活菌數：按照國標GB 4789.35—2016《食品安全國家標準食品微生物學檢驗乳酸菌檢驗》中平板計數法[27]；pH值：采用pH計；總酸度：參照文獻[28]及國標GB/T 5009.239—2016《食品酸度的測定》[29]；游離氨基酸：參照文獻[30]及國標GB/T 5009.124—2016《食品中氨基酸的測定》[31]；菌落總數、大腸菌群、霉菌、酵母及致病菌的檢測：按照國標GB/T 4789.21—2003《食品衛生微生物學檢驗冷凍飲品、飲料檢驗》[32]。

1.3.9 數據處理

試驗數據采用Microsoft Excel 2010、Minitab 17.0、Origin 8.0等數據處理軟件進行整理及統計分析作圖。

2 結果與分析

2.1 發酵過程中活菌數、GABA含量和pH值的變化

菌株發酵過程中活菌數、GABA含量及pH值變化見圖1。由圖1可知，在發酵前16 h，乳酸菌增長顯著，此時GABA的合成較為緩慢，pH值則呈顯著下降趨勢；發酵24 h后，乳酸菌進入生長穩定期，其活菌數不再發生顯著性變化，此時為GABA的主要合成期；而到了48 h，GABA含量不再發生顯著性變化，同時發酵液的pH值也趨于穩定。因此，選擇發酵時間為48 h，此時發酵飲料中的GABA含量為1.98 g/L，乳酸菌含量＞1×1010CFU/mL，pH值為4.0左右，符合作為乳酸菌飲品基質的條件[33]。

圖1 功能性乳酸菌飲品發酵過程中活菌數、γ-氨基丁酸含量和pH值的變化Fig.1 Changes of viable bacterial count,γ-aminobutyric acid contents and pH value during fermentation process of functional lactic acid bacteria beverage

2.2 功能性乳酸菌飲品配方優化

2.2.2 正交試驗

由10名感官評定人員對9組調配的功能乳酸菌飲品進行感官評價，其結果見表4。

將表4中各樣品因素等級所得票數與總票數進行折算，得到模糊矩陣R。例如將樣品1的模糊矩陣R1與權重集K合成得到樣品1的綜合評價集Y1為：

表4 功能性乳酸菌飲料的感官評定結果Table4 Results of sensory evaluation of functional lactic acid bacteria beverage

將綜合評價集Y1和評語集V合成得到樣品1的感官得分W1，即W1=0.41×10+0.15×8+0.24×5+0.2×2=6.90。同理可得到W1、W2……W9。

2.2.1 單因素試驗

蜂蜜添加量、碳酸鈣添加量及阿斯巴甜添加量對感官得分的影響見圖2。

圖2 蜂蜜（A）、碳酸鈣（B）及阿斯巴甜（C）添加量對功能性乳酸菌飲品感官評價的影響Fig.2 Effect of honey (A),calcium carbonate (B) and aspartame (C) addition on sensory evaluation of functional lactic acid bacteria beverage

由圖2A可知，當蜂蜜添加量為5%時，感官評分最高為（8.9±0.1）分。此時飲品的色澤呈均一的深褐色，同時具有濃郁的乳酸香氣；隨著蜂蜜添加量的增加，乳酸香氣逐漸變淡，蜂蜜添加量過多時，蜂蜜甜味過濃，顏色逐漸變淺，呈淺褐色；蜂蜜添加量較低時，無明顯蜂蜜味。經綜合考慮，選取蜂蜜添加量為4%、5%、6%進行正交試驗。

由圖2B可知，當碳酸鈣的添加量為0.30%時，感官評分最高為（8.8±0.15）分。此時飲品的色澤呈均一的深褐色，口感較好，同時具有濃郁的乳酸香氣；隨著碳酸鈣添加量的增加，乳酸香氣逐漸變淡，碳酸鈣添加量過多時，乳酸味過淡，顏色逐漸變淺，呈深黃色；碳酸鈣添加量較低時，口感較酸。經綜合考慮，選取碳酸鈣添加量為0.25%、0.30%、0.35%進行正交試驗。

由圖2C可知，當阿斯巴甜的添加量為0.010 0%時，感官評分最高為（9.1±0.09）分。此時的飲品酸甜可口，同時具有濃郁的乳酸香氣；隨著阿斯巴甜添加量的增加，乳酸味逐漸變淡，阿斯巴甜添加量過多時，口感過甜，并略有苦后味；阿斯巴甜添加量較低時，口感較酸。經綜合考慮，選取阿斯巴甜添加量為0.007 5%、0.010 0%、0.012 5%進行正交試驗。

以模糊數學評定法對正交試驗各試驗組的樣品進行感官評價，結果見表5，方差分析結果見表6。

表5 功能性乳酸菌飲品配方優化正交試驗結果與分析Table5 Results and analysis of orthogonal tests of formula optimization for functional lactic acid bacteria beverage

由表5可知，各因素對飲品感官評分的影響順序為蜂蜜添加量＞阿斯巴甜添加量＞碳酸鈣添加量。最佳配方組合為A3B3C2，即蜂蜜添加量6%，碳酸鈣添加量0.35%，阿斯巴甜添加量0.01%。在此最佳配比下進行3次平行驗證試驗，感官評分為最高8.52分。所得飲品色澤均一、酸甜可口、香氣適宜、口感細膩。由表6可知，蜂蜜添加量對飲品感官評分影響顯著（P＜0.05）；碳酸鈣和阿斯巴甜對飲品感官評分影響不顯著（P＞0.05）。

表6 功能性乳酸菌飲品配方優化正交試驗結果方差分析Table6 Variance analysis of orthogonal tests results of formula optimization for functional lactic acid bacteria beverage

2.3 穩定劑配比優化

2.3.1 單因素試驗

瓊脂添加量（A）、黃原膠添加量（B）、CMC-Na添加量（C）對穩定性的影響見圖3。

圖3 瓊脂（A）、黃原膠（B）及CMC-Na（C）添加量對功能性乳酸菌飲品穩定性的影響Fig.3 Effects of agar (A),xanthan gum (B) and CMC-Na (C) addition on stability of functional lactic acid bacteria beverage

由圖3A可知，隨著瓊脂添加量在0.05%～0.25%范圍內的增加，離心沉淀率呈現出逐漸升高的趨勢。當瓊脂添加量為0.05%時，此時的離心沉淀率達到最低，為（2.56±0.10）%。當瓊脂添加量繼續增加，離心沉淀率也隨之增加。因此，選擇0.05%、0.10%、0.15%3個水平進行正交試驗優化。

由圖3B可知，隨著黃原膠添加量在0.05%～0.25%范圍內的增加，離心沉淀率呈現出先降低后升高的趨勢。當黃原膠添加量為0.15%時，此時的離心沉淀率達到最低，為（2.31±0.11）%。當黃原膠添加量繼續增加，離心沉淀率也隨之增加。因此，選擇0.10%、0.15%、0.20%3個水平進行正交試驗優化。

由圖3C可知，隨著CMC-Na的添加量在0.05%～0.25%范圍內的增加，離心沉淀率呈現出逐漸降低的趨勢。當黃原膠添加量為0.20%時，此時的離心沉淀率達到最低，為（2.35±0.12）%。當CMC-Na添加量繼續增加，離心沉淀率也有所增加。因此，選擇0.10%、0.15%、0.20%3個水平進行正交試驗優化。

2.3.2 正交試驗

在單因素試驗的基礎上，以離心沉淀率為主要評價指標，考察瓊脂、黃原膠和CMC-Na添加量對功能性乳酸菌飲品穩定性的影響，正交試驗結果與分析見表7，方差分析結果見表8。

由表7可知，各因素對飲品穩定性的影響順序為CMC-Na添加量＞黃原膠添加量＞瓊脂添加量。最佳穩定劑的配比組合為A2B3C2，即瓊脂添加量0.10%，黃原膠添加量0.20%，CMC-Na添加量0.15%。在此最佳配比下進行3次平行驗證試驗，所得飲品的離心沉淀率為1.92%、穩定效率為68.18%。由表8可知，CMC-Na添加量對飲品穩定性影響顯著（P＜0.05），瓊脂和黃原膠添加量對飲品穩定性影響不顯著（P＞0.05）。

表7 穩定劑配比優化正交試驗結果與分析Table7 Results and analysis of orthogonal tests for stabilizer ratio optimization

表8 穩定劑配比優化正交試驗結果方差分析Table8 Variance analysis of orthogonal tests results of stabilizer ratio optimization

綜上所述，功能性乳酸菌飲品的最佳配方為：蜂蜜添加量6%，碳酸鈣添加量0.35%，阿斯巴甜添加量0.01%，穩定劑最佳配比為：瓊脂添加量0.10%，黃原膠添加量0.20%，CMC-Na添加量0.15%。

2.4 功能性乳酸菌飲品分析檢測

對功能性乳酸菌飲品成品氨基酸進行分析檢測，結果見見表9。

表9 功能性乳酸菌飲品氨基酸含量分析Table9 Amino acid contents analysis of functional lactic acid bacteria beverage

續表

由表9可知，飲品中共檢出游離氨基酸18種，除GABA外，還包括7種必需氨基酸；其中谷氨酸、甘氨酸、賴氨酸及天氡氨酸等功能性氨基酸的含量均≥0.1 g/100 g。

2.5 貯藏期飲品的品質變化

將在上述最佳配方及穩定劑條件下制得的飲品成品置于常溫（20～25 ℃）下貯藏，并對其進行監測，貯藏期間成品各項指標的監測結果見表10。由表10可知，隨著貯藏時間的延長，乳酸菌活菌數的減少趨勢較為顯著，第30天時減少了約38%，第60天時減少了約80%，而到了第90天，其數量仍在108CFU/mL以上；pH值則由4.46降低為3.65；而GABA含量則未發生明顯變化，由此可見GABA含量未受到貯存時間的影響。

表10 貯藏期間成品各項指標的監測結果Table10 Monitoring results of various indexes of finished products during storage

2.6 功能性乳酸菌飲品質量指標

感官指標：飲品色澤均一、酸甜可口、香氣適宜、口感細膩，感官評分為8.52分。

理化指標：蛋白質1.960 g/100 g，總酸19.160 g/kg，游離氨基酸（18種）1.82 g/100 g。

微生物指標：乳酸菌活菌數1.026×1010CFU/mL；雜菌總數＜10 CFU/mL；大腸菌群＜3 MPN/100 mL；霉菌及酵母＜10 CFU/mL；致病菌未檢出。

3 結論

本研究以色澤、香氣、口感、組織狀態為評價因素，結合正交試驗設計，采用模糊數學模型對GABA乳酸菌飲品進行綜合評判，最終得到飲品最佳配方為：以乳酸菌發酵飲料為基質，添加蜂蜜6%、碳酸鈣0.35%、阿斯巴甜0.01%。此條件下得到的飲品色澤呈均一深褐色、酸甜可口、乳酸香氣濃郁，感官評分為最高的8.52分；飲品穩定劑的最佳配比為：瓊脂0.10%、黃原膠0.20%、CMC-Na 0.15%。在此條件下所得飲品的離心沉淀率為1.92%、穩定效率為68.18%，穩定性較高。采用上述配方條件制備的乳酸菌飲品中GABA的含量為1.98 g/L，乳酸菌活菌數達1.026×1010CFU/mL，且其中富含多種其他氨基酸等益生因子，具有一定的保健功能且在常溫下具有較好的貯藏性，為富含GABA的功能性乳酸菌飲品的產業化生產奠定堅實的基礎。