干蟾皮炮制前后兩種毒性成分的含量比較*

周 謐，朱 琳，傅興圣

1 南通市食品藥品監(jiān)督檢驗(yàn)中心，南通 226006；2 三明市尤溪縣中醫(yī)醫(yī)院，福建三明365000

干蟾皮為蟾蜍科動(dòng)物中華大蟾蜍Bufo bufo gargarizans Cantor 的干燥皮[1]。干蟾皮辛、涼，有毒，具有清熱解毒、利水消脹之功效，臨床用于治療小兒疳積、咽喉腫痛、腫瘤；外治癰腫疔瘡。干蟾皮的化學(xué)成分較復(fù)雜，主要含有蟾蜍毒素，為多種強(qiáng)心甾體化合物的總稱，在干燥加工過(guò)程中分解為蟾毒配基類成分，主要包括華蟾酥毒基、脂蟾毒配基、蟾毒靈、日蟾毒它靈等，具有一定的毒性[2]。臨床大多使用其炮制品，以砂炒為主，炮制后毒性降低，但缺乏炮制降毒機(jī)理的研究支持。前期曾采用高效液相色譜法對(duì)干蟾皮和炒干蟾皮中的華蟾酥毒基、脂蟾毒配基、蟾毒靈、日蟾毒它靈、沙蟾毒精等5 種毒性成分進(jìn)行測(cè)定，其中華蟾酥毒基、脂蟾毒配基這兩種成分含量較高，分離效果較好；而蟾毒靈、日蟾毒它靈、沙蟾毒精這3 種成分在炒干蟾皮中的含量極低，難以進(jìn)行比較。本文采用高效液相色譜法對(duì)華蟾酥毒基、脂蟾毒配基這兩種主要毒性成分進(jìn)行含量測(cè)定[3，4]，比較干蟾皮炮制前后兩種成分含量的變化，同時(shí)綜合分析炮制后毒性降低的機(jī)理。

1 儀器與藥品、試劑

Ulimate 3000 型雙三元高效液相色譜儀（美國(guó)Thermo Fisher Scientific 公司）；CP225D 電子分析天平（德國(guó)Sartorius 公司）。

脂蟾毒配基對(duì)照品（批號(hào)：110718-201108）、華蟾酥毒基對(duì)照品（批號(hào)：110803-200605）均為中國(guó)藥品生物制品檢定所提供；蟾毒靈（批號(hào)：CAS＃465-21-4 W05D6Z7090）為上海倍卓科技公司提供；甲醇、乙腈為色譜純，其余試劑為分析純；水為純化水。

本實(shí)驗(yàn)共收集了10 批生品（產(chǎn)地：S1、S2、S8 為南通如東，實(shí)地收集：S3～S7、S9、S10 為安徽亳州藥材市場(chǎng)）和8 批炮制品（產(chǎn)地：C1、C2、C8 為安徽亳州藥材市場(chǎng)，C3 為南通如東，實(shí)地收集：C4、C7 為南通市精華制藥，C5 為南通市三越中藥飲片公司，C6為江蘇華康中藥飲片公司），經(jīng)由南通市食品藥品監(jiān)督檢驗(yàn)中心龔旭東主任中藥師鑒定確認(rèn)。

2 方法與結(jié)果

2.1 樣品的炮制

干蟾皮飲片（生品）：取原藥材，除去雜質(zhì)及灰屑，切去頭爪，切成小塊或片，洗凈，干燥。制干蟾皮飲片（砂炒）：取砂子置鍋內(nèi)，用武火炒熱后加入凈干蟾皮塊，拌炒至焦黃發(fā)泡時(shí)，取出，篩去砂子，放涼[5]。飲片見(jiàn)圖1。

圖1 干蟾皮樣品圖

2.2 色譜條件

色譜柱：DIKMA C18（4.6×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈-0.5%磷酸二氫鉀（50∶50）（用磷酸調(diào)節(jié)pH值3.2）；柱溫：30 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：296 nm；流速：1.0 mL·min-1；進(jìn)樣量：20 μL。

2.3 溶液的制備

2.3.1 對(duì)照品溶液精密稱取華蟾酥毒基、脂蟾毒配基對(duì)照品各10 mg，分別置于100 mL 量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為對(duì)照品貯備液。分別精密吸取貯備液各5 mL，置同一50 mL 量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.3.2 供試品溶液取干蟾皮粉末（粗粉）約1.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50 mL，稱定重量，超聲振蕩處理（功率500 W，頻率40 kHz）30 min，放冷，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.3.3 空白溶液取甲醇作為空白溶液，按“2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果顯示，空白溶液在與華蟾酥毒基、脂蟾毒配基對(duì)照品色譜峰保留時(shí)間處無(wú)色譜峰，表明空白溶劑對(duì)測(cè)定沒(méi)有干擾。

2.4 方法學(xué)驗(yàn)證

2.4.1 系統(tǒng)適用性要求理論板數(shù)按華蟾酥毒基峰計(jì)算應(yīng)不低于10000，相鄰色譜峰之間分離度均符合要求。見(jiàn)圖2。

圖2 高效液相色譜圖

2.4.2 線性關(guān)系制備分別精密吸取“2.3.1”對(duì)照品溶液適量,配制成華蟾酥毒基濃度分別為1.02、2.04、5.09、10.18、25.44、50.88 μg·mL-1，脂蟾毒配基濃度分別為0.97、1.94、4.85、9.71、24.27、48.54 μg·mL-1的系列混合對(duì)照品溶液，分別進(jìn)樣20 μL，記錄峰面積，以濃度（μg·mL-1）為橫坐標(biāo)X，以峰面積（mAu）為縱坐標(biāo)Y，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。華蟾酥毒基回歸方程為Y=11.203X+0.022，r=0.9999；脂蟾毒配基回歸方程為Y=10.895X-0.151 5，r=0.999 9。結(jié)果表明，華蟾酥毒基對(duì)照品濃度在1.02～50.88 μg·mL-1、脂蟾毒配基對(duì)照品濃度在0.97～48.54 μg·mL-1呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。

2.4.3 進(jìn)樣精密度試驗(yàn)取一定濃度的對(duì)照品溶液20 μL，連續(xù)進(jìn)樣6 次，記錄峰面積。結(jié)果華蟾酥毒基峰和脂蟾毒配基的峰面積RSD 分別為0.21%、0.42%。

2.4.4 穩(wěn)定性試驗(yàn)取同一份干蟾皮供試品溶液（S2），分別于0、1、2、4、6、12、24、36、48 h 進(jìn)樣20 μL，華蟾酥毒基和脂蟾毒配基峰面積的RSD 分別為0.42%和0.67%，表明供試品溶液在48 h 內(nèi)穩(wěn)定。

2.4.5 專屬性考察在“2.2”項(xiàng)色譜條件下，華蟾酥毒基、脂蟾毒配基均峰形良好，無(wú)雜質(zhì)干擾，保留時(shí)間分別為12.6 min、13.5 min。

2.4.6 重復(fù)性試驗(yàn)取同一批干蟾皮供試品（S8）1.5 g，共6 份，分別精密稱定，依法制備供試品溶液，按“2.2”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定。結(jié)果華蟾酥毒基含量的RSD 為1.45%，脂蟾毒配基含量的RSD 為2.34%。

2.4.7 加樣回收率試驗(yàn)精密稱取已知含量的干蟾皮樣品（S2）0.75 g，共9 份，按低、中、高濃度（每個(gè)濃度3 份，低、中、高濃度分別為0.8∶1、1∶1、1∶1.2）分別加入三個(gè)濃度的混合對(duì)照品溶液，按“2.3”項(xiàng)下的方法制備供試品溶液，按“2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見(jiàn)表1。注：華蟾酥毒基平均回收率：99.49%，RSD 2.64%；脂蟾毒配基平均回收率：97.30%；RSD 1.85%

表1 華蟾酥毒基和脂蟾毒配基加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n=9）

2.4.8 耐用性試驗(yàn)選擇不同廠家色譜柱（DIKMA C18，250mm×4.6mm，5μm；Waters C18，250mm×4.6mm，5 μm 和Merck C18，150 mm×4.6 mm，5 μm）及不同型號(hào)的高效液相色譜儀（戴安Ulimate3000 雙三元；島津LC-20A 和安捷倫1200）測(cè)定各供試品，結(jié)果顯示，不同廠家色譜柱和不同型號(hào)的儀器均能對(duì)樣品進(jìn)行較好分離，適用性良好。

2.5 樣品測(cè)定

分別取不同產(chǎn)地的10 批生品（S1～S10）和8 批炮制品（C1～C8），按“2.3”項(xiàng)下的方法制備供試品溶液，進(jìn)樣高效液相色譜儀，測(cè)定華蟾酥毒基和脂蟾毒配基的色譜峰面積，用線性關(guān)系計(jì)算含量，以干燥品計(jì)，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 干蟾皮樣品來(lái)源及含量測(cè)定結(jié)果

3 討論

在10 批干蟾皮生品和8 批干蟾皮炮制品中，2種成分的含量差異較大，表明干蟾皮的質(zhì)量參差不齊；干蟾皮藥材S1、S2 為產(chǎn)地采集，2 項(xiàng)指標(biāo)均高于市場(chǎng)收集批次，差異明顯；制干蟾皮飲片C4、C7 為南通市精華制藥生產(chǎn)，2 項(xiàng)指標(biāo)均高于其他收集批次，差異明顯。在干蟾皮生品中，華蟾酥毒基的含量為0.14～1.74 mg·g-1，均值為0.53 mg·g-1；脂蟾毒配基的含量為0.02～3.16 mg·g-1，均值為0.75 mg·g-1；制蟾皮中華蟾酥毒基的含量為0.02～0.41 mg·g-1，均值為0.17 mg·g-1；脂蟾毒配基的含量為0.004～0.87 mg·g-1，均值為0.22 mg·g-1。檢測(cè)表明，在炮制品中，2 種毒性成分的含量低于生品。此外，有3 批生品（S6、S7、S8）委托南通市三越中藥飲片公司炮制，生品與相應(yīng)炮制品測(cè)定結(jié)果顯示，2 種毒性成分經(jīng)過(guò)炒制均呈不同程度的降低，華蟾酥毒基平均下降46%，下降程度在批間相差不大；脂蟾毒配基平均下降65%，下降程度在批間相差很大。邏輯性的表明，炒制后毒性降低。

干蟾皮藥材有著較好的療效，但也存在一定的毒性作用，通過(guò)炮制，則可降低其毒性，保證使用后既達(dá)到應(yīng)有的療效，又不致產(chǎn)生不良反應(yīng)。華蟾酥毒基和脂蟾毒配基既是毒性成分，也是藥效成分。通過(guò)對(duì)炮制前后干蟾皮中的這2 種毒性成分的比較研究，炮制后其含量有不同程度的降低，與干蟾皮炮制減毒的目的相符。干蟾皮炮制減毒的機(jī)理之一是通過(guò)砂炒加熱，使毒性成分含量下降。本實(shí)驗(yàn)首次開(kāi)展的干蟾皮炮制減毒機(jī)理研究，為干蟾皮安全有效、穩(wěn)定可控應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。