好氧反硝化菌的固定化及其效能研究

尹超 李瑩 張婷月 劉佳敏 陳體達 崔丹 黃民生

摘要： 為了提高好氧反硝化菌的環境耐受性和脫氮效率， 采用聚乙烯醇（PVA）、海藻酸鈉（SA）和稻殼粉作為載體對好氧反硝化菌進行固定化， 并對固定化顆粒的性能進行評價. 結果如下： 固定化顆粒最佳配比為12%聚乙烯醇（PVA）、8%海藻酸鈉（SA）、0.5 g稻殼粉和10 mL菌液; 固定化顆粒具有較好的穩定性和傳質性， 48 h的總氮（TN）去除率為89.35% ～ 90.12%. 固定化顆粒對pH值和轉速具有良好的耐受性， pH值為11時， TN去除率為90%; 120 r/min時TN和NH4+-N去除率最高， 分別為91.29%和93.30%; 固定化顆粒不耐低溫（10℃和15℃）， 在10℃時， TN去除率僅為20%左右; 但是在30℃時， TN去除率可達90.59%.

關鍵詞： 好氧反硝化菌; 固定化; 脫氮

中圖分類號： X522 文獻標志碼： A DOI： 10.3969/j.issn.1000-5641.2021.04.001

Immobilization and efficacy of an aerobic denitrifier

YIN Chao1，2，3，4， LI Ying1，2，3，4， ZHANG Tingyue1，2，3，4， LIU Jiamin1，2，3，4， CHEN Tida1，2，3，4， CUI Dan1，2，3，4， HUANG Minsheng1，2，3，4

（1. Shanghai Key Laboratory for Urban Ecological Processes and Eco-Restoration， School of Ecological and Environmental Sciences， East China Normal University， Shanghai 200241， China; 2. Institute of EcoChongming， Shanghai 202162， China; 3. Shanghai Engineering Rearch Center of Biotransformation of Organic Solid Waste， Shanghai 200241， China; 4. Technology Innovation Center for Land Spatial EcoRestoration in Metropolitan Area （Ministry of Natural Resources）， Shanghai 200062， China）

Abstract： To improve the environmental tolerance and nitrogen removal efficiency of an aerobic denitrifier， polyvinyl alcohol （PVA）， sodium alginate （SA）， and rice hull powder were used as immobilized carriers for an aerobic denitrifier and the performance was subsequently evaluated. The results showed that the optimal ratio of immobilized particles was a mixture of 12% PVA， 8% sodium alginate （SA）， 0.5 g rice hull powder， and 10 mL bacterial solution. The immobilized particles had strong stability and mass transfer capability; the removal efficiency of TN was 89.35% ～ 90.12% over 48h. The immobilized particles had good tolerance to pH and rotating speed. When the pH was 11， the removal efficiency of TN was 90%. The removal efficiency of TN and NH4+-N was the highest （91.29% and 93.30%， respectively） when the speed was 120 r/min. The immobilized particles were not resistant to low temperatures （10℃ and 15℃）， and the TN removal efficiency was only about 20% at 10℃. The TN removal efficiency， however， achieved 90.59% at 30℃.

Keywords： aerobic denitrifer; immobilization; denitrification

0 引 言

好氧反硝化菌因同時具有硝化-反硝化功能、環境適應性強等特點而逐漸成為處理氮污染水體的新生力量[1-4]. 但是實際工程中若直接利用好氧反硝化菌修復水體， 很可能會因為水量波動、雨水沖刷、噬菌體吞噬、有毒物質抑制等因素導致菌體流失、死亡， 使得水體的修復效果變差[5-6]. 研究表明，利用包埋固定化技術固定微生物能夠提高微生物抗沖擊能力、防止微生物流失、提高脫氮效率[7-9]. 例如， 將海藻酸鈉（SA）與Klebsiella sp. FC61細菌混合固定， NH4+-N去除率由61.37%提高到72.15%[10];利用固定化技術包埋活性污泥后， NH4+-N去除率能達100%[11]. Zhou等[12]利用氧化石墨烯（GO）對聚乙烯醇（PVA）進行改性， 發現改性組的COD去除率比未改性組提高10%. 現階段研究微生物固定化主要還集中于價格昂貴的材料， 大規模使用的可操作性仍值得商榷. 探索利用廉價添加劑（稻殼粉）作為固定化材料， 不僅降低固定化成本、提供碳源、增加孔隙率， 而且能有效解決農林廢棄物的問題.

基于此， 本研究以前期篩選出的好氧反硝化菌群LHJ-1為研究對象， 探討以PVA、SA和稻殼粉為主要固定化材料對好氧反硝化菌的脫氮性能進行提升; 并探究固定化材料的最佳配比及固定化顆粒對環境因子（轉速、pH值、溫度）的耐受性進行分析， 旨在為好氧反硝化菌固定化技術在實際氮超標的城鎮污水的應用上提供一定的理論指導.

1 材料與方法

1.1 好氧反硝化菌及DTM培養基

好氧反硝化菌主要來自龍泓澗底泥的富集培養. DTM液體培養基由C4H4Na2O4 0.405 1 g/L、KNO3 1.000 0 g/L、KH2PO4 0.007 0 g/L、K2HPO4 0.027 0 g/L、MgSO4 0.005 0 g/L和微量元素溶液（2.000 0 mL/L）組成. 其中， 微量元素溶液組成由EDTA 100.0 mg/L、ZnSO4 4.4 mg/L、CaCl2 11.0 mg/L、MnCl2·7H2O 10.2 mg/L、FeSO4·7H2O 10.0 mg/L、（NH4）6Mo7O24·4H2O 2.2 mg/L、CuSO4·5H2O 3.2 mg/L、CoCl2·6H2O 3.2 mg/L組成[13].

1.2 固定化顆粒制備

向含100 mL水燒杯中加入定量的PVA、SA、稻殼粉， 用無菌封口膜封住并置于水浴鍋（85℃）中溶解. 待冷卻至室溫后加入定量菌液并緩慢攪拌， 避免產生氣泡， 然后放入生化培養箱中培養4 h. 同時， 向飽和硼酸溶液中加入3%的CaCl2， 并調節pH值至6.5 ～ 7.0， 配制成交聯劑. 培養4 h后用醫用注射器將PVA-SA-稻殼粉混合液緩慢加入CaCl2-硼酸飽和溶液中， 并使用玻璃棒緩慢攪拌， 防止顆粒粘連， 交聯4 h后轉入0.5 mol/L的Na2SO4溶液中再交聯1 h. 取出后用0.9% NaCl溶液沖洗， 放入冰箱中保存.

1.3 固定化顆粒性能評價

（1）穩定性： 向含100 mL蒸餾水的錐形瓶中加入30顆固定化顆粒， 于120 r/min（高速）、30℃搖床中培養48 h， 然后觀察顆粒破裂情況.

（2）傳質性能： 向高溫滅菌的DTM液體培養基中加入30顆固定化顆粒， 于120 r/min、30℃搖床中培養48 h， 測定OD600.

（3） TN去除率： 向高溫滅菌的DTM液體培養基中加入30顆固定化顆粒， 于120 r/min、30℃搖床中培養48 h， 測定TN去除率.

1.4 固定化顆粒環境因子耐受性分析

向100 mL滅菌DTM液體培養基（以NH4Cl為唯一氮源， 碳氮比為8）中加入30顆固定化顆粒，并放入恒溫搖床中進行培養. 實驗中設置不同的搖床轉速（0、30、60、90、120 r/min）、不同的實驗溫度（10、15、20、25、30℃）、不同的實驗pH值（5、6、7、9、11）. 考察48 h后， TN、NH4+-N、NO3–-N、NO2–-N的濃度變化、細菌生長情況和顆粒破裂情況， 進一步探究固定化顆粒對環境因子的耐受性.

1.5 實驗指標分析

OD600由紫外分光光度法測定， TN采用堿式過硫酸鉀消解紫外分光光度法， NH4+-N采用納氏試劑法， NO3–-N采用紫外分光光度法， NO2–-N采用N-（1-萘基）-乙二胺光度法測定.

2 結果與討論

2.1 固定化載體配比優化

為了確定固定化載體質量分數的范圍， 首先進行了預實驗（見表1）. 根據預實驗結果， 最終設置參數： PVA 濃度為8%、9%、10%， SA濃度為0.4%、0.6%、0.8%， 稻殼粉為0 g、0.5 g、1 g， 菌液量為5 mL、10 mL、15 mL， 進行正交試驗， 以TN去除率作為響應值. 固定化載體配比優化正交試驗見表2，其中因素A為PVA（%），因素B為SA（%），因素C為稻殼粉（g），因素D為菌液（mL）. 由表3實驗結果可知，， 最優配比組合為8%的PVA、0.6%的SA、0.5 g的稻殼粉和10 mL的菌液， TN去除率為79.02%.而根據極差結果顯示當配比組合為8%的PVA、0.6%的SA、0.5 g的稻殼粉和5 mL的菌液時， TN去除率最高. 但是實際實驗結果表明， 理論最佳配比組合的TN去除率為77.81%， 小于以TN去除率為基準的最佳配比組合. 因此， 實驗最終以8%的PVA、0.6%的SA、0.5 g的稻殼粉和10 mL的菌液為最佳載體配比. 此外， 由極差（R）分析可知， 4個因素對TN去除率的貢獻程度為稻殼粉 > PVA > SA >菌液， 說明碳源是好氧反硝化過程中最重要的影響因素.

2.2 固定化顆粒性能評價

2.2.1 穩定性評價

穩定性是固定化效果的重要評價指標之一. 固定化顆粒需具有一定的機械強度以抵抗外界環境的沖擊， 保護體內微生物不被破壞， 維持較高的微生物濃度， 提高其重復利用率. 因此， 對固定化顆粒進行48 h的高速（120 r/min）機械強度實驗， 通過肉眼觀察結果表明， 實驗組中30顆固定化顆粒的外觀未出現破裂、變形現象. 通過游標卡尺測量顆粒平均直徑發現， 實驗前和實驗后的30顆固定化顆粒平均直徑并未發生明顯增大現象. 用玻璃片夾住小球進行按壓， 發現顆粒仍具有與新鮮顆粒相同的彈性. 綜上所述， 固定化顆粒具有良好的穩定性和一定的機械強度.

2.2.2 傳質性能評價

固定化顆粒的傳質性能直接影響顆粒內外部的物質交換， 從而影響微生物活性和污染物的去除速率. 將顆粒和1 mL菌液分別接種于液體培養基中， 置于恒溫搖床進行實驗， 通過對比實驗中OD600值的大小分析顆粒的傳質性能. 48 h后測得顆粒組OD600值為0.121， 而游離菌組OD600值為0.116. 說明顆粒不僅具有良好的傳質性能， 同時還能促進微生物的生長.

2.2.3 TN去除率評價

提高固定化顆粒的脫氮效率是對微生物進行固定化最重要的原因， 因此將顆粒移至液體DTM培養基中進行實驗. 3組平行樣中顆粒均未破裂， 且菌液OD600值分別為0.123、0.118、0.107， TN的去除率分別為90.59%、89.37%、88.16% （平均值為89.37%）， 比未固定化的游離菌脫氮效率（76.73%）高12.64%. 將上述3組顆粒再進行相同實驗， 菌液OD600值分別為0.108、0.089、0.101， TN的去除率分別為91.08%、90.12%、89.35% （平均值為90.18%）， 比游離菌脫氮效率高13.45%. 以上實驗說明， 固定化顆粒不僅具有良好的脫氮能力， 還具有重要的重復利用率， 具有很大的應用潛力.

2.3 固定化顆粒的環境因子耐受性分析

環境因子的變化不但能影響固定化顆粒物理性能（機械強度、傳質性能等）， 而且能通過影響微生物的活性、濃度來影響好氧反硝化菌脫氮效率. 因此， 有必要研究不同環境因子（轉速、溫度、pH值）下固定化顆粒的耐受性， 通過分析微生物的生長、氮轉化來評價固定化顆粒抗沖擊性能和對微生物的保護能力.

2.3.1 轉速耐受性分析

對于好氧反硝化菌來說， 溶解氧濃度直接影響好氧反硝化酶活性， 從而影響反硝化速率. 因此， 在實驗中通過提高轉速來增加液體培養基內溶解氧的濃度[14-16]. 提高轉速還可以使微生物與培養基充分接觸， 促進微生物的生長. 此外， 提高轉速還會提高固定化顆粒之間的碰撞概率， 用以考察固定化顆粒的機械強度. 因此， 研究固定化顆粒在不同轉速下的耐受性是十分必要的.

圖1為不同轉速對顆粒脫氮效果的影響。由圖可知， TN去除率和NH4+-N去除率隨著轉速的增大而增大. 當轉速為120 r/min時TN去除率和NH4+-N去除率最高， 分別為91.29%和93.30%. 但轉速增大到150 r/min時， TN去除率略有下降. 這可能是因為： ①當轉速較大時， 顆粒間碰撞機率增大，產生較大的摩擦力， 影響顆粒穩定性， 導致TN去除率降低; ②過快的轉速會使細胞相互碰撞、破碎，細胞胞內氮溢出， 導致TN去除率下降. 此外， 實驗中硝化作用不明顯， NO3–-N和NO2–-N幾乎沒有積累. 當轉速為0時， OD600值為0.003， 微生物幾乎不生長. 當轉速提高到60 r/min時， 菌液OD600值最大（0.134）， 可能是因為此時產生的溶解氧適合LHJ-1混合菌群中的兼性反硝化菌生長.

2.3.2 溫度耐受性分析

微生物的新陳代謝速率是由體內的酶活性決定的， 而酶活性與外界的溫度息息相關， 溫度過低或者過高， 都會抑制酶活性[17-19]. 圖2為不同溫度對顆粒脫氮效果的影響。由圖2可知， 隨著溫度的增大， TN和NH4+-N去除率也隨之增大. 當溫度小于20℃時， 細菌幾乎不生長， TN去除率均在20%左右;硝化作用也不明顯， NO3–-N和NO2–-N積累較少. 說明過低的溫度會抑制微生物的酶活性. 當溫度為25℃時， OD600值增長到0.098， TN和NH4+-N去除率分別達到77.40%和65.55%. 當溫度為30℃時， TN和NH4+-N去除率分別可達90.59%和92.86%. 與游離菌相比， TN去除率提高約10%， 可能是固定顆粒中的稻殼粉為微生物生長提供了額外的碳源[13].

2.3.3 pH耐受性分析

圖3為不同pH值對顆粒脫氮效果的影響。從圖3可以看出， 當pH值為5時， 菌液OD600值最小0.003， 細菌幾乎不生長， TN和NH4+-N去除率也低. 可能是因為過低的pH環境會導致微生物的核酸和表面蛋白發生水解， 影響微生物對營養物質的吸收， 抑制微生物新陳代謝[20-21]. 此外， 實驗中觀察到固定化顆粒發生自溶， 這會對微生物的保護作用減弱， 導致脫氮效率偏低. 當pH值為6時， 固定化菌群表現出較高的脫氮效率， TN和NH4+-N去除率分別為84.00%和85.55%; 說明微生物能夠很好地利用外部營養物質進行生長繁殖， 也說明固定化載體對低pH環境起到緩沖作用. 當pH值超過7時， TN去除率隨pH值增大而增大， 且均超過90%. 說明好氧反硝化菌對中堿性環境有較好的適應性且具有高效的脫氮性能[22]. pH值為7時， NO3–-N積累濃度為1.97 mg/L， 但是隨著pH值增大， NO3–-N積累濃度不明顯. 原因可能是硝化作用是一個產酸過程， 當溶液為弱堿性時， 能中和產生的H+， 加速硝化作用的進行.

3 結 論

利用交聯法固定微生物不僅可以避免微生物流失， 還可以提高微生物的穩定性和處理效能， 但是交聯材料價格昂貴、孔隙率低、傳質性能低等缺點是其難以應用的主要原因. 本研究將農林廢棄物與交聯法結合， 不僅可以發揮傳統固定化材料的優點， 還可以降低生產成本、提供碳源、提高材料孔隙率、提升微生物耐惡劣環境沖擊能力等.

本文通過將PVA、SA、稻殼粉以及菌液進行優化配比作為好氧反硝化菌載體材料， 以期獲得的固定化顆粒具有一定的穩定性、傳質性和環境耐受性， 具體結果如下.

（1）利用正交試驗分析可知， 實際最佳載體配比為8%的PVA、0.6%的SA、0.5 g的稻殼粉以及10 mL菌液， TN去除率為79.02%， 且固定化顆粒具有良好的穩定性、傳質性和較高的脫氮效率.

（2）固定化顆粒的脫氮效率隨轉速和溫度的增大而增大， 120 r/min時TN去除率達到最大（91.29%）; 固定化顆粒受溫度影響較大， 隨著溫度的升高， 脫氮效率明顯提高， 溫度為30℃時， TN和NH4+-N去除率分別可達90.59%和92.86%. 此外， 固定化顆粒酸度耐受性提高， 當pH值為6時， TN和NH4+-N去除率分別為84.00%和85.55%. 因此， 固定化顆粒能夠耐酸， 但是不耐低溫. 此外， 溶解氧濃度也是影響其效率的因素之一.

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（責任編輯： 張 晶）