碳化方法消除透射電鏡生物樣品中鋨黑顆粒的體會

張彩麗，劉湘花，李 欣，孫 寧，高鴻建

鋨酸后固定是生物電鏡樣品制備中的關鍵環節。如果鋨酸固定后清洗不徹底，則在乙醇脫水過程中會出現組織內的四氧化鋨被還原成二氧化鋨并沉淀在組織內，電鏡下呈現黑色的細小顆粒(鋨黑顆粒)。這種人工假象不但掩蓋了組織結構的細節，而且混淆結果的判斷。本實驗通過對比常規方法前處理和碳化方法前處理結果，分析碳化方法前處理在避免出現鋨黑顆粒方面的優勢，現介紹如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1標本 收集2017～2019年河南中醫藥大學中醫藥科學院電鏡中心接收的送檢實驗動物標本825例，其中包括肺、腎、心、腦、肝組織，其中行常規方法前處理組600例，碳化方法前處理組225例。

1.1.2主要儀器設備 日本電子JEM-1400生物透射電鏡、徠卡全自動樹脂處理機(LeicaEMTP)、徠卡全自動超薄切片機(LeicaEMUC7)戴通鉆石刀、瑯玕智能電熱恒溫培養箱(DHP-9050B)、超純水機(Milli-Q)、離心機(長沙湘智TGL16)、碳化船艙(自制)。

1.1.3試劑 (1)812環氧樹脂；(2)丙酮；(3)梯度乙醇；(4)0.1 mol/L PBS(pH 7.2)；(5)1%鋨酸水溶液；(6)醋酸雙氧鈾染液；(7)檸檬酸鉛染液。

1.2 方法

1.2.1組織樹脂塊制備 組織送檢時已用2.5%戊二醛固定4～24 h，按前處理流程分為常規方法前處理和碳化方法前處理。(1)常規方法前處理流程。①PBS漂洗：15 min×4次；②后固定：1%鋨酸內浸泡固定1.5 h；③PBS漂洗：15 min×4次；④梯度乙醇脫水：50%→70%→80%→90%乙醇各15 min→100%乙醇15 min×2次→100%丙酮15 min×2次；⑤浸透：1 ∶1→2 ∶1樹脂丙酮各2 h；⑥包埋：硅膠板內純環氧樹脂包埋；⑦聚合：37 ℃ 12 h→45 ℃ 12 h→60 ℃ 24 h。(2)碳化方法前處理流程：操作步驟引自“生物電鏡樣品碳化方法”(中國專利CN201410183132.2)[1]，具體操作由專利發明人高鴻建老師指導。

1.2.2超薄切片與鉛鈾雙染色 用電動砂輪打磨掉組織周邊多余樹脂后在顯微鏡下用刀片將組織頭修切成錐形，然后在超薄切片機上切出70 nm厚的薄片，銅網撈片，晾干；鉛-鈾雙染色；電鏡下觀察拍照。

1.3 結果判定細胞內出現非結構性散在或密集的點狀高電子密度顆粒為陽性。

2 結果

常規方法前處理組600例中鋨黑顆粒陽性標本57例，肺、腎、心、腦、肝組織細胞內均出現大量鋨黑顆粒沉淀，顆粒密集雜亂，與游離核糖體相參雜，遮蓋了局部細胞器超微結構的細節，對結果的分析造成了干擾(圖1)；碳化方法前處理組225例中鋨黑顆粒陽性0例，各組織細胞內超微結構清晰(圖2)。

圖1 常規方法前處理組：A.肺泡隔膠原原纖維之間、毛細血管內皮細胞及血管腔內大量鋨黑顆粒沉淀，顆粒密集，與游離核糖體相參雜；B.腦組織內突觸小體及突觸小泡內充滿雜亂無章的鋨黑顆粒；C.腎小管上皮細胞內充斥著大量的鋨黑顆粒，遍布線粒體內；D.肝臟組織中鋨黑顆粒分布在肝細胞線粒體、內質網、糖原區各個角落；E.心肌細胞內鋨黑顆粒分布在心肌粗、細肌絲及線粒體內 圖2 碳化方法前處理組：A.肺組織內無鋨黑顆粒沉積；B.腦組織內無鋨黑顆粒沉積；C.腎小管內無鋨黑顆粒沉積；D.肝組織內無鋨黑顆粒沉積；E.心肌細胞內無鋨黑顆粒沉積

3 討論

透射電鏡生物樣品觀察需要高質量的超薄切片，并盡量減少人工假象[2]。樣品制備過程包括取材、固定、脫水、浸透、包埋、切片及染色等諸多步驟，過程中使用的化學試劑種類繁多。為獲得理想的超薄切片，操作者必須謹慎對待每一步驟，任何環節的疏忽均有可能導致制片失敗[3]。在實際工作中，我們經常會碰到各種各樣的問題，如污染、人工假象等。因此不斷提高制片質量也是電鏡工作者不斷追求的目標。劉湘花等[4-5]在超薄切片染色方法的改進中指出多個染色細節，減少了染色污染幾率，并從超薄切片厚度、電鏡物理參數優化等方面進行探索，總結了幾點提高生物電鏡樣品圖像反差及清晰度的經驗。李寧寧等[6]則強調了鉆石刀在生物樣品超薄切片制備中的優勢，并指出其在提高制片質量方面的使用技巧與注意事項，這些經驗對我們的實際工作有很大幫助。

鋨黑顆粒作為一種人工假象，時下已成為電鏡同仁熱議的話題，鋨黑顆粒來自鋨酸的不當殘留。鋨酸對生物樣品有固定和電子染色雙重作用，具有很強的揮發性，用鋨酸固定時，組織結構與鋨離子結合，獲得高反差電子圖像[7-8]。鋨酸浸泡固定時鋨酸分子分散在組織內，若漂洗不充分，鋨酸則殘余在組織內，乙醇脫水時，四氧化鋨被還原成二氧化鋨，組織內就形成了鋨黑顆粒沉淀。另外，采用戊二醛-鋨酸雙固定時，在鋨酸固定之前，需將殘余在組織內多余的及結合不牢的戊二醛漂洗干凈，否則它們將與鋨酸反應，產生細小而致密的鋨沉淀使組織結構遭受破壞。根據這些原理，為避免鋨黑顆粒的出現，作者曾使用梯度丙酮取代梯度乙醇脫水以及多次長時間漂洗的方案，結果發現這兩種方案雖能在一定程度上減少鋨黑顆粒，但卻無法杜絕。而且由于丙酮對組織的抽提，出現了組織塊變脆，超薄切片困難，組織難以成片的問題，而長時間的漂洗又出現了組織水腫等問題。

碳化方法是復旦大學基礎醫學院電子顯微鏡中心實驗室高鴻建老師的專利發明。運用碳化方法進行前處理的優點：(1)從根源上杜絕了鋨黑顆粒的出現。一方面碳化過程中采用鋨酸熏蒸方法，組織并非浸泡于鋨酸溶液中，避免了由于組織內外鋨酸濃度差造成的過多鋨酸分子在組織內殘留而形成鋨黑顆粒。另一方面省去了乙醇脫水步驟，在根源上杜絕了鋨黑顆粒沉淀產生的因素；(2)對組織結構尤其膜結構顯示更加清晰；(3)無鋨酸后固定之后的漂洗，杜絕了因漂洗過度帶來的組織水腫破壞；(4)碳化方法流程簡單，節約試劑耗材，尤其是鋨酸的使用量明顯減少，且可以多次重復使用，從而間接地保護了工作人員。使用碳化方法前處理時需要注意：(1)組織塊大小不同對碳化時長要求不同，一般為0.5～2 h不等，1 mm×1 mm×1 mm的樣品需碳化1 h，稍大的或者含膠原較多的組織塊需碳化2 h，腎穿刺樣品需碳化0.5 h；(2)組織成分不同碳化時長亦不同：植物樣品成分與動物樣品成分不同，碳化時間需要延長。

需要強調的是并非常規方法前處理方案處理后標本中就一定會出現鋨黑顆粒沉積，各實驗室應根據自身情況摸索出適合本實驗室的樣品處理條件，如遇頑固性鋨黑顆粒困擾，碳化方法不失為一種良好的挽救方法。