神經重癥醫學科感染患者非多重耐藥肺炎克雷伯菌的毒力基因分布與傳播特征分析

元小冬，張萍淑，劉妍，李妍，耿賀梅，王賀永，張淑清，劉青

肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae，KP）是神經重癥醫學科（Neurological Intensive Care Unit，NICU）患者感染的主要病原菌，多見于呼吸道、泌尿道、血液感染［1-2］。近年耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌（Carbapenem-resistant Klebsiella pneumoniae，CRKP）逐漸增多，全球耐藥率達20%～70%，其耐藥基因可由質粒介導，通過轉化、接合、轉導等形式傳遞，進而形成多重耐藥菌［3］，目前關于KP的毒力基因特征已成為臨床的研究熱點。全基因組測序技術（whole genome sequencing，WGS）能夠直接反映基因組DNA的遺傳信息，對確定耐藥基因型、預測細菌耐藥表型的特異度、靈敏度較高，能夠較全面地了解病原菌來源、感染、耐藥、傳播等機制［3］，為本課題組對細菌基因組中攜帶毒力基因與其臨床致病機制的關系研究提供了有力的技術支撐。本課題組在NICU感染患者中篩選出具有特定同源關系的非多重耐藥KP進行全基因組測序，并應用多種生物信息學軟件在全基因組測序中篩選出其攜帶的毒力基因，進而分析其分布和傳播特征，以期為KP感染的防控提供依據。

1 資料與方法

1.1 樣本來源 收集2015—2018年開灤總醫院收治的93例NICU感染患者的非多重耐藥KP 94株。所有KP應用K-B法進行抗菌藥物敏感試驗及脈沖場凝膠電泳法（PFGE）進行同源性分析，將相似度為100%視為同一克隆株，相似度≥80%視為同一流行克隆系［4］。選出其中的無同源性KP 3株，即2015年、2016年、2017年各1株，分別編號為P20、P39、P66；2018年，選出與P66為同一流行克隆系的KP 2株，分別編號為P90、P91，且P90與P91為同一克隆株。

1.2 WGS 將5株非多重耐藥KP進行二代、三代全基因組測序，將所得的基因組測序結果上傳至NCBI的prokaryotic annotation pipeline系統，進行基因組預測基因注釋，并應用BLAST軟件進行對比分析，獲取病原菌毒力因子數據庫（Virulence Factors Datebase，VFDB），比對基因注釋結果，篩選條件：一致性＞80%，E值＞0。

2 結果

2.1 NICU感染患者的臨床特征 在選出的5例NICU非多重耐藥KP感染患者中，男4例，女1例；年齡50～76歲，平均（66.0±10.5）歲；疾病類型：肺炎4例、肺炎+泌尿系統感染1例；抗生素（青霉素類/頭孢類/大環內酯類）用藥種類：1種3例，≥2種2例；侵入性操作：泌尿道插管5例、鼻飼營養3例、呼吸機通氣2例、氣管插管2例、動靜脈插管1例、氣管切開1例。

2.2 NICU感染患者非多重耐藥KP的毒力基因類型 將NICU感染患者5株非多重耐藥KP的基因組測序結果與VFDB進行比對，結果發現，在5株非多重耐藥KP中共篩選出6大類52種毒力基因，其中黏附類17種（32.7%）、鐵吸收類15種（28.8%）、分泌系統類15種（28.8%）、調節類3種（5.8%）、內毒素類1種（1.9%）、侵入類1種（1.9%），其中P20攜帶19種（36.5%）、P39攜帶18種（34.6%）、P66攜帶2種（3.8%）、P90攜帶47種（90.4%）、P91攜帶49種（94.2%），見表1。

表1 NICU感染患者非多重耐藥KP的毒力基因類型〔n（%）〕Table 1 Toxicity gene type of non-multiple-resistant KP in patients with NICU infection

2.3 NICU感染患者非多重耐藥KP的毒力基因注釋結果NICU感染患者非多重耐藥KP的基因注釋結果顯示：（1）黏附類毒力基因：P90、P91中均檢出fimA、fimB、fimC、fimE、fimF、fimG、fimH、fimI、ecpB、ecpE、ecpR、mrkA、mrkB、mrkD、mrkF、yagZ/ecpA、fliY基因各1個，P20、P39中僅檢出1個fliY基因，P66未檢出此類毒力基因。（2）鐵吸收類毒力基因：在同一克隆株P90、P91中均檢出fepB、fepC、fepD、fepG、entA、entB、entS、iroE、ybtA、ybtX、sitB、sitC基因各1個，P90還檢出1個ybtT基因，其同一流行克隆系P66檢出iucB、iroC基因各1個，P20、P39均未檢出此類毒力基因。（3）分泌系統類毒力基因：P20、P39、P90、P91中均檢出ECS88-3547、pulB、pulD、pulH、pulI、pulJ、pulK、pulM、pulN、pulO、pulS基 因 各 1個，P20、P90、P91均檢出1個EC55989-3327基因，P20、P39、P91均檢出pulC、pulG基因，P91檢出1個EC55989-3335基因，P66未檢出此類毒力基因。（4）調節類毒力基因：P20、P39、P90、P91中均檢出fur、PMI0229基因各1個，P90、P91還各檢出1個phoP基因，P66未檢出此類毒力基因。（5）在P20、P39、P90、P91中均檢出1個內毒素類毒力基因（kdsA基因）和1個侵入類毒力基因（Z1307基因）。

2.4 NICU感染患者非多重耐藥KP毒力基因表達的毒力因子 NICU患者非多重耐藥KP全基因組中，黏附類毒力基因表達的毒力因子包括Ⅰ型菌毛（fimA、fimB、fimC、fimE、fimF、fimG、fimH、fimI）、Ⅲ型菌毛（mrkA、mrkB、mrkD、mrkF）、大腸桿菌菌毛 ECP（ecpB、ecpE、ecpR、yagZ/ecpA）、腹膜鞭毛AⅠ139（fliY）；鐵吸收類毒力基因表達的毒力因子包括腸桿菌素（entA、entB、entS、fepB、fepC、fepD、fepG）、耶爾西菌素（ybtA、ybtT、ybtX）、氣桿菌素（iucB）、沙門菌素（iroC、iroE）、鐵/錳酶轉運（sitB、sitC）；分泌系統類毒力基因表達的毒力因子包括Ⅱ型分泌系統（T2SS）（pulB、pulC、pulD、pulG、pulH、pulI、pulJ、pulK、pulM、pulN、pulO、pulS）和Ⅵ型分泌系統（T6SS）（EC55989-3327、EC55989-3335、ECS88-3547）； 調 節 類毒力基因表達的毒力因子包括Fur（fur）、PhoPQ（phoP）、ABC轉運蛋白通透酶（PMI0029）；內毒素類毒力基因表達的毒力因子為LOS（kdsA）；侵入類毒力基因表達的毒力因子為OmpA（Z1307）。

3 討論

KP是引發NICU患者呼吸道感染的主要病原菌，可通過克隆形式在病房環境和患者中傳播和定植［5］。KP感染的發病機制較復雜，與其攜帶的毒力基因激活后表達的毒力因子有關，其主要毒力因子及其傳播形式目前尚不完全明確。

本研究將NICU感染患者5株非多重耐藥KP的基因組測序結果與VFDB進行比對，結果發現，5株非多重耐藥KP中共篩選出52種毒力基因，其中P20攜帶19種（36.5%）、P39攜帶18種（34.6%）、P66攜帶2種（3.8%）、P90攜帶47種（90.4%）、P91攜帶49種（94.2%），可見NICU感染患者的非多重耐藥KP基因組（P90、P91）中存在著大量的毒力基因。本研究結果還顯示，NICU感染患者的非多重耐藥KP全基因組中檢出6大類共52種毒力基因，其中黏附類毒力基因最多，為17種（32.7%），主要毒力因子包括Ⅰ型菌毛（fimA、fimB、fimC、fimE、fimF、fimG、fimH、fimI）、Ⅲ型菌毛（mrkA、mrkB、mrkD、mrkF）、大腸桿菌菌毛ECP（ecpB、ecpE、ecpR、yagZ/ecpA）、腹膜鞭毛AⅠ139（fliY）。Ⅰ型菌毛和Ⅲ型菌毛黏附于宿主黏膜表面或與宿主細胞進行充分接觸是導致KP感染的首要環節［6］，其中Ⅰ型菌毛能夠穿過KP莢膜基質向外延伸，并調節細菌對宿主上皮細胞的D-甘露糖-敏感性黏附［7］；Ⅲ型菌毛可使KP牢固地黏附于人體呼吸道、消化道和泌尿生殖道等部位的黏膜上皮細胞，并促使KP在宿主表面形成生物被膜，其中fimH、mrkD基因分別編碼Ⅰ型和Ⅲ型菌毛黏附因子［8-10］，可見KP攜帶的大量黏附類毒力基因是使其黏附、固定于患者各腔道部位上皮細胞并促進生物被膜形成而致病的重要遺傳學基礎。

本研究結果還發現，NICU感染患者的5株非多重耐藥KP攜帶的鐵吸收類毒力基因多達15種（28.8%），主要毒力因子包括腸桿菌素（entA、entB、entS、fepB、fepC、fepD、fepG）、耶爾西菌素（ybtA、ybtT、ybtX）、氣桿菌素（iucB）、沙門菌素（iroC、iroE）、鐵/錳酶轉運（sitB、sitC）；分泌系統類基因表達的毒力因子包括Ⅱ型分泌系統（T2SS）（pulB、pulC、pulD、pulG、pulH、pulI、pulJ、pulK、pulM、pulN、pulO、pulS）和Ⅵ型分泌系統（T6SS）（EC55989-3327、EC55989-3335、ECS88-3547）。研究表明，鐵是細菌生物代謝、電子傳遞等生命活動中重要的氧化還原催化劑［11］。KP無法在宿主內直接獲得鐵元素，其主要通過分泌鐵載體來獲取，而鐵載體是細菌分泌的高親和力的胞外鐵離子螯合劑，可與宿主鐵結合蛋白釋放的Fe3+相結合。腸桿菌素作為腸桿菌科細菌產生的一種鄰二苯酚鹽型鐵載體蛋白，與鐵具有較高的親和力，主要通過結合血漿轉鐵蛋白中的鐵來促進細菌生長［12］，且KP腸桿菌素合成基因entB的表達還可促進其生物被膜成熟。另外，耶爾西菌素作為混合型鐵載體蛋白，與鐵具有中等親和力［13］，其可在機體缺鐵狀態時激活外膜蛋白FyuA來促進KP生物被膜形成；氣桿菌素是一種氧肟酸鹽與羧酸鹽混合型鐵載體，與鐵親和力不高，但其可高效利用其他細菌合成的氣桿菌素而發揮作用［14］。耶爾西菌素、氣桿菌素均可阻斷活性氧產生，間接降低宿主先天免疫細胞的滅菌能力。沙門菌素及其受體iroN均是由基因簇iroA（iroBCDN）編碼合成，其是一種鄰苯二酚鹽型鐵載體，具有較高的鐵親和力，沙門菌素螯合鐵可促進細菌復制而導致細菌感染的發生發展［15］，其特征性的抗氧化劑作用還可催化產生羥自由基，進而加重組織損傷，增強細菌的致病力。因此，KP攜帶的鐵吸收類基因表達的毒力因子在促進細菌生長、生物被膜成熟、加重組織損傷、感染傳播等方面具有重要作用。

研究表明，細菌的分泌系統可通過跨膜轉運特定的生物大分子實現分泌毒力蛋白等各種生物因子，以適應環境的變化，進而使細菌在宿主內定植、繁殖、擴散而致?。?6］。目前在革蘭陰性菌中已經發現了9種蛋白分泌系統，可根據分泌系統跨越內膜和外膜方式分為單膜鑲嵌分泌系統和雙膜鑲嵌分泌系統，依據效應物的釋放方式可將其分泌機制分為一步分泌機制和兩步分泌機制［17］。本研究發現，NICU感染患者非多重耐藥KP攜帶的分泌系統類毒力基因達15種，主要為Ⅱ型分泌系統（T2SS）和Ⅵ型分泌系統（T6SS），T2SS主要攜帶pul基因簇（pulB、pulC、pulD、pulG、pulH、pulI、pulJ、pulK、pulM、pulN、pulO、pulS），pul基 因 序 列 中pulC到pulO構成了一個獨立操縱子，而pulB、pulS位于其附近，可將支鏈淀粉酶分泌蛋白轉運到壁膜間隙，再由12～16個蛋白組成的精細分泌裝置將其轉運到細胞外，完成兩步分泌機制的過程［18］。KP可以利用Ⅱ型分泌系統分泌毒力因子，還可為毒力因子生存提供必要的營養物質。本研究在KP檢出的T6SS主要包括EC55989-3327、EC55989-3335、ECS88-3547基因，均屬于雙膜鑲嵌分泌系統，是一種接觸依賴性蛋白分泌裝置，其效應物通過一步分泌機制直接從細胞質被靶定至細胞外或宿主細胞內，可在不同環境中產生細菌拮抗，將毒素注射到目標細胞中可避免KP受損、促進菌落的形成與定植，進而導致宿主感染［19-20］。因此，KP攜帶的Ⅱ型、Ⅵ型分泌系統類毒力基因表達合成的分泌蛋白不但可為自身提供生存保障，還可進一步損傷宿主細胞功能。

本研究結果顯示，NICU感染患者的5株非多重耐藥KP全基因組中，共檢出調節類毒力基因3種、內毒素類毒力基因1種、侵入類毒力基因1種，調節、內毒素、侵入類毒力基因表達的毒力因子具有保護細菌逃避宿主的免疫殺傷、抵抗巨噬細胞吞噬及發揮損傷宿主細胞功能等作用［21］。同時，本研究結果顯示，KP攜帶的黏附類毒力基因除表達為腹膜鞭毛AⅠ139因子的fliY基因外，其他僅存于以克隆傳播的P90、P91中，提示黏附類毒力基因主要以克隆形式在KP中進行傳播。同樣，鐵吸收類毒力基因也僅存于同一流行克隆系的P66、P90、P91中，其中腸桿菌素和耶爾西菌素類的合成基因主要存在于同一克隆株P90、P91中，而氣桿菌素和沙門菌素類的合成基因主要存在于P90的同一流行克隆系P66中，因此鐵吸收類毒力基因主要以同一流行克隆系形式在KP中進行傳播。但并未發現KP攜帶的分泌系統類、調節類、侵入類、內毒素類毒力基因傳播與KP的傳代方式有明顯關系。同時，本課題組發現同一克隆KP毒力基因類型明顯多于同一流行克隆系KP，表明以克隆方式傳代的KP具有更強致病毒力的遺傳學基礎，且黏附類和鐵吸收類毒力因子是其致病毒力更強的主要原因。

綜上所述，NICU感染患者非多重耐藥KP中攜帶著大量的致病毒力基因，主要為黏附類、鐵吸收類、分泌系統類毒力基因，還有少量的調節類、內毒素類、侵入類毒力基因。黏附類和鐵吸收類毒力基因以克隆方式進行傳播，這也是以克隆方式傳代的KP具有更強致病毒力的遺傳學基礎。但本研究為單中心研究，樣本量較少，同時缺少多重耐藥菌的基因組對比分析，今后仍需多中心研究進一步完善相關分析。

作者貢獻：元小冬、張萍淑、劉妍進行文章的構思與設計，進行結果分析與解釋；張萍淑、劉妍進行研究的實施與可行性分析；劉妍、李妍、耿賀梅、王賀永、張淑清、劉青進行數據收集、整理、分析；元小冬撰寫論文，負責文章的質量控制及審校，并對文章整體負責、監督管理；劉妍、李妍、劉青進行論文的修訂。

本文無利益沖突。