河南地區葉酸相關代謝酶基因多態性分析

張珂，肖瑞霞，修賀明

(河南金泰生物技術股份有限公司，河南 鄭州 450000)

葉酸參與體內多種生化反應，對維持染色體穩定起著重要作用[1]。葉酸本身無活性，需要5，10-亞甲基四氫葉酸還原酶(5，10-methylenetetrahydrofolate reductase，MTHFR)與甲硫氨酸合成酶還原酶(methionine synthase reductase，MTRR)的參與才能發揮活性并維持體內葉酸的正常代謝[2]。MTHFR和MTRR突變后酶活性降低，導致體內同型半胱氨酸水平升高及DNA低甲基化，從而引起多種疾病。葉酸缺乏是新生兒神經缺陷發生的主要病因，育齡婦女適當補充葉酸可有效預防新生兒出生缺陷的發生[3-5]。本研究對河南地區MTHFR和MTRR基因多態性進行分析，為個體化增補葉酸及降低疾病發生率提供遺傳學依據。

1 對象與方法

1.1 研究對象根據知情同意的原則，對河南地區受檢人群進行遺傳檢測，排除DNA抽提不符合要求者，共獲取有效樣本數量344例，其中男173例，女171例。

1.2 DNA采集與基因分型采集受檢者的口腔黏膜上皮細胞，利用柱式抽提試劑盒進行DNA抽提，抽提試劑盒采購于上海生工。采用AGENA公司Mass ARRAY?DNA質譜陣列基因分析系統進行MTHFRC677T、A1298C和MTRRA66G基因多態性的檢測。通過ASSAY DESIGN SUITE V2.0進行在線引物設計，引物信息見表1。聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction，PCR)反應分為3步(多重PCR反應，SAP反應，iPLEX延伸反應)進行，檢測試劑盒為Complete iPLEX?Gold Genotyping Reagent Set 10X96。多重PCR反應：95 °C預變性2 min，45個循環(95 °C 30 s，56 °C 30 s，72 °C 1 min)，72 °C延伸5 min。SAP反應：37 °C 40 min，85 °C 5 min，4 °C 2 min。iPLEX反應：94 °C 30 s，40個循環(94 °C 5 s)，5個循環(52 °C 5 s，80° C 5 s)，72 °C 5 min。反應體系見表2。PCR反應結束后，利用分析軟件確定各個樣本的基因分型結果。

表1 引物序列信息

表2 PCR反應條件

1.3 統計學方法對基因分型頻數進行Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗，采用SPSS 20.0統計軟件進行基因頻數和等位基因頻率的統計分析。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 Hardy-Weinberg遺傳平衡分析本研究共有受檢者344例，其中男173例，女171例。MTHFRC677T位點檢出3種基因型：野生型CC、雜合突變型CT、純合突變型TT；MTHFRA1298C位點檢出3種基因型：野生型AA、雜合突變型AC、純合突變型CC；MTRRA66G位點檢出3種基因型：野生型AA、雜合突變型AG、純合突變型GG。MTHFRC677T、A1298C和MTRRA66G基因位點基因型實際頻數與理論頻數吻合度良好，Hardy-Weinberg遺傳平衡結果證明基因多態性分布符合遺傳平衡法則(P>0.05)，樣本具有區域樣本代表性。見表3。

2.2MTHFR和MTRR基因頻數和等位基因頻率MTHFRC677T基因位點野生型CC 85例(24.71%)，雜合突變型CT 162例(47.09%)，純合突變型TT 97例(28.20%)，C677T位點C等位基因頻率為48.26%，T等位基因頻率為51.74%。MTHFRA1298C基因位點野生型AA 242例(70.35%)，雜合突變型AC 89例(25.87%)，純合突變型CC 13例(3.78%)，A1298C位點A等位基因頻率為83.28%，C等位基因頻率為16.72%。MTRRA66G基因野生型AA 191例(55.52%)，雜合突變型AG 131例(38.08%)，純合突變型GG 22例(6.40%)，A66G位點A等位基因頻率為74.56%，G等位基因頻率為25.44%。男女受檢者MTHFRC677T、A1298C和MTRRA66G的基因型頻率分布比較，差異無統計學意義(P>0.05)。見表4。

表3 河南地區葉酸代謝MTHFR及MTRR基因位點Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗

表4 MTHFR C677T、A1298C和MTRR A66G位點基因型頻率[n(%)]

2.3 河南地區女性MTHFR、MTRR等位基因頻數和頻率與其他地區的比較

2.3.1MTHFRC677T 河南地區女性MTHFRC677T等位基因和基因型頻率分布情況與武漢[6]、瓊海[7]比較，差異有統計學意義(χ2=23.136、129.891，P<0.001)；其分布情況與尚志[8]、煙臺[9]、太原[10]比較，差異無統計學意義(χ2=3.182、3.064、0.802，P=0.204、0.216、0.670)。見表5。

表5 不同地區女性MTHFR C677T基因型頻數和頻率比較[n(%)]

2.3.2MTHFRA1298C 河南地區女性MTHFRA1298C等位基因和基因型頻率分布情況與瓊海[7]比較，差異有統計學意義(χ2=11.854，P=0.003)；其分布情況與武漢[6]、尚志[8]、煙臺[9]、太原[10]比較，差異無統計學意義(χ2=0.970、1.500、2.393、2.379，P=0.616、0.472、0.302、0.304)。見表6。

表6 不同地區女性MTHFR A1298C基因型頻數和頻率比較[n(%)]

2.3.3MTRRA66G 河南地區女性MTRRA66G等位基因和基因型頻率分布情況與武漢[6]、瓊海[7]、尚志[8]、煙臺[9]、太原[10]比較，差異無統計學意義(χ2=0.083、0.705、0.339、5.412、1.665，P=0.959、0.703、0.844、0.067、0.435)。見表7。

表7 不同地區女性MTRR A66G基因型頻數和頻率比較[n(%)]

3 討論

MTHFR、MTRR是葉酸代謝過程中的關鍵酶。MTHFR基因在葉酸代謝通路中將5，10-亞甲基四氫葉酸轉化為具有生物學功能的5-甲基四氫葉酸。MTRR能夠通過還原型甲基化作用重新生成具有功能活性的甲硫氨酸合酶。兩者使血液中的同型半胱氨酸保持在一個較低的水平。同型半胱氨酸的蓄積可增加各種心血管疾病的發生，損害和干擾心血管生長發育。近年研究也驗證了高同型半胱氨酸血癥與阿爾茨海默病相關[11-12]。在制定葉酸補充方案時，需要考慮遺傳因素，做到個性化補充。

MTHFRC677T基因多態性突變位點位于MTHFR的第4外顯子，該突變導致纈氨酸向222密碼子丙氨酸轉化，這是一種降低酶活性的常見多態性。MTHFR677 CT型酶活性可下降30%～40%，而純合突變型TT個體酶活性下降60%～70%[13]。本研究結果顯示，MTHFRC677T基因位點T等位基因頻率為51.74%，CT、TT基因型頻率為47.09%、28.20%。這與中國人群中約29%的MTHFR677TT基因型結果保持一致[14-15]。女性MTHFRC677T位點基因型與武漢[6]、瓊海[7]不一致。這表明MTHFRC677T多態性分布具有明顯的地域特征。

A1298C是MTHFR基因的另一個主要變異位點，其突變使氨基酸序列中的谷氨酸被丙氨酸代替，導致MTHFR酶活性降低。MTHFRC677T、A1298C兩處的突變存在協同作用，雙突變后酶活性僅為野生型的15%左右[6,16]。本研究結果顯示，河南人群中1298AC基因型頻率25.87%，純合突變型CC 3.78%，1298CC基因型頻率3.78%，C等位基因頻率為16.72%。但研究發現單一MTHFRA1298C基因突變位點與新生兒神經管畸形、新生兒先天性心臟病、高同型半胱氨酸血癥等發生并無明顯相關性[17-19]。MTRRA66G突變可導致第22位的氨基酸發生變化，原有的異亮氨酸被甲硫氨酸取代，酶活性降低，增加神經管畸形等出生缺陷的發病風險。

本研究中，河南地區MTHFR和MTRR基因多態性分布不受性別影響，且多數人群存在葉酸代謝障礙、葉酸利用能力不足等情況。對于一般人群，補充葉酸的有效且安全劑量為每日0.4～1.0 mg[11,20-21]。建議無高危因素的育齡婦女每日增補葉酸0.4 mg或0.8 mg，直至妊娠滿3個月。MTHFR677位點TT基因型婦女可根據個體情況酌情增加葉酸補充劑量或延長孕前增補時間。推薦合并高同型半胱氨酸血癥的心血管疾病高危人群和高血壓患者每日服用0.8 mg葉酸或聯合服用維生素B12以達到最佳的降低同型半胱氨酸水平的效果。需注意長期大劑量補充葉酸(包括葉酸強化食物)有可能產生健康風險，如增加某些癌癥(結直腸癌和前列腺癌等)風險，掩蓋維生素B12缺乏的早期表現，加重神經系統退行性病變，與其他藥物相互干擾影響鋅吸收或降低葉酸吸收率，降低免疫力，增加婦女妊娠高血壓和妊娠糖尿病的風險等[21-24]。

綜上所述，針對葉酸代謝障礙、育齡婦女等特殊人群，開展基因檢測了解相關基因的多態性并評估葉酸代謝能力對幫助臨床醫生制定個體化葉酸補充方案有重要意義。