組蛋白去甲基化酶KDM5C在炎癥性腸病中的作用研究

陳 萍 朱 華 余亞莉 毛宇娟 卓明星 陳 敏 葉 梅

炎癥性腸病(IBD)是一種非特異性的腸道慢性炎性疾病，包括潰瘍性結(jié)腸炎(UC)和克羅恩病(CD)，其發(fā)病機(jī)制目前尚未完全明確。多項(xiàng)研究顯示，表觀(guān)遺傳通過(guò)調(diào)控基因表達(dá)、影響炎性反應(yīng)表型而參與IBD的發(fā)生、發(fā)展。UC患者結(jié)腸組織中總基因組DNA甲基化水平明顯低于正常人，且其在疾病活動(dòng)期的水平也明顯低于非活動(dòng)期[1]。Tsaprouni等[2]在2，4，6-TNBS誘導(dǎo)的慢性結(jié)腸炎小鼠和CD患者腸黏膜中均發(fā)現(xiàn)組蛋白H4(賴(lài)氨酸殘基8、12位點(diǎn))高乙酰化。用葡聚糖硫酸鈉(DSS)誘導(dǎo)的急性結(jié)腸炎模型研究發(fā)現(xiàn)，結(jié)腸炎組織中一氧化氮合酶(iNOS)、IL-6和TNF-α等炎性因子呈高表達(dá)，其基因啟動(dòng)子區(qū)域H3K27ac的富集水平也顯著升高[3]。

KDM5C是由X染色體編碼轉(zhuǎn)錄的去甲基化酶，可以催化組蛋白H3K4me2/3脫甲基，使H3K4me2/3的激活轉(zhuǎn)錄作用減弱，在維持DNA準(zhǔn)確復(fù)制、神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育和腫瘤細(xì)胞增殖等方面起著重要作用[4]。近年來(lái)研究顯示，KDM5C在結(jié)腸癌、前列腺癌和肝細(xì)胞癌中呈高表達(dá)[5-6]，在結(jié)腸癌細(xì)胞中沉默KDM5C可降低其對(duì)奧沙利鉑的耐藥性[7]。而在膽管細(xì)胞癌中，KDM5C可通過(guò)參與脂肪酸代謝抑制腫瘤細(xì)胞的侵襲和遷移[8]。目前尚未見(jiàn)KDM5C在自身免疫性疾病及炎性疾病中的相關(guān)研究報(bào)道。本研究用葡聚糖硫酸納(DSS)誘導(dǎo)小鼠慢性結(jié)腸炎模型，檢測(cè)KDM5C的表達(dá)變化，并利用KDM5C基因敲除(KDM5C-/-)小鼠建立急性結(jié)腸炎模型，探討KDM5C在小鼠結(jié)腸炎進(jìn)程中的作用及機(jī)制，為進(jìn)一步研究KDM5C在結(jié)腸炎發(fā)病機(jī)制中的作用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來(lái)源

收集2019年11月至2020年9月期間在武漢大學(xué)中南醫(yī)院接受手術(shù)治療的8例潰瘍性結(jié)腸炎(UC)患者、10例克羅恩病(CD)患者的結(jié)腸黏膜組織標(biāo)本，另選擇7例結(jié)腸息肉患者的結(jié)腸黏膜組織標(biāo)本作為正常對(duì)照。取材后將標(biāo)本迅速保存于-80 ℃冰箱以備實(shí)時(shí)熒光定量PCR(real-time qPCR)等檢測(cè)使用。所有患者均知情同意，本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

本研究采用26只無(wú)特定病原體(SPF)級(jí)C57BL/6野生型(WT)雄性小鼠，6～8周齡，體質(zhì)量為18～22 g，由本院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。KDM5C-/-小鼠雄性純合子3只(C57BL/6小鼠)，6～8周齡，體質(zhì)量為16～19 g，由武漢大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院李楓教授惠贈(zèng)。小鼠飼養(yǎng)在SPF環(huán)境中，恒溫(21 ℃～22 ℃)，12 h明暗循環(huán)，自由飲水飲食。在實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前，小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周。

1.3 主要材料與試劑

葡聚糖硫酸鈉(DSS)購(gòu)自美國(guó)MP Biomedicals公司。多聚甲醛、H-E染液購(gòu)自Biosharp公司。EASY spin組織/細(xì)胞RNA快速提取試劑盒購(gòu)自北京艾德萊生物科技有限公司。逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自日本Toyobo公司。SYBR-Green real-time qPCR試劑盒購(gòu)于康為世紀(jì)生物科技有限公司。引物由武漢擎科生物技術(shù)有限公司合成。

1.4 構(gòu)建小鼠慢性結(jié)腸炎模型

將小鼠隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組1(n=10)和對(duì)照組1(n=10)。參照chen等[9]的方法構(gòu)建慢性結(jié)腸炎模型。將DSS粉末溶于高壓滅菌蒸餾水配制成2.5%DSS溶液，實(shí)驗(yàn)組1小鼠自由飲用2.5%DSS溶液7 d后飲用蒸餾水14 d，如此循環(huán)3次，末次給藥后第5天處死小鼠，對(duì)照組1小鼠全程自由飲用蒸餾水。每天觀(guān)察記錄小鼠的體質(zhì)量、糞便性狀和糞便帶血情況。于第54天斷頸處死兩組小鼠，解剖取出完整結(jié)腸，取2 cm遠(yuǎn)端結(jié)腸，用4%多聚甲醛溶液固定后行病理檢查。將剩余結(jié)腸組織保存于-80 ℃冰箱備用。

1.5 構(gòu)建小鼠急性結(jié)腸炎模型

將小鼠分為對(duì)照組2(WT小鼠)、實(shí)驗(yàn)組2(WT小鼠+3%DSS)和實(shí)驗(yàn)組3(KDM5C-/-小鼠+3%DSS)，每組3只小鼠。參照Bauer等[10]的方法構(gòu)建小鼠急性結(jié)腸炎模型。將DSS粉末溶于高壓滅菌蒸餾水配制成3%DSS溶液，實(shí)驗(yàn)組2和實(shí)驗(yàn)組3小鼠給予自由飲用3%DSS溶液7 d，對(duì)照組2全程自由飲用蒸餾水。每天觀(guān)察并記錄各組小鼠的體質(zhì)量、糞便性狀和糞便帶血情況、毛色及活動(dòng)狀況。疾病活動(dòng)指數(shù)評(píng)分(DAI)參照Wirtz 等[11]的評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)，詳見(jiàn)表1。于第8天斷頸處死各組小鼠，取完整結(jié)腸，測(cè)量長(zhǎng)度并拍照。取2 cm遠(yuǎn)端結(jié)腸，用4%多聚甲醛溶液固定后行病理檢查。將剩余結(jié)腸組織保存于-80 ℃冰箱備用。

表1 DAI評(píng)估標(biāo)準(zhǔn)

1.6 小鼠結(jié)腸組織切片制備

處死小鼠后取0.5 cm遠(yuǎn)端結(jié)腸，置于4%多聚甲醛溶液中固定，經(jīng)乙醇脫水，先行透明處理，再完成浸蠟、包埋、切片、烤片和切片脫蠟處理。脫蠟蒸餾水浸洗2 min后行H-E染色，染色完成后自來(lái)水洗滌，透明，封片。最后進(jìn)行鏡檢及圖像采集分析。

1.7 real-time qPCR檢測(cè)

將收集的人體結(jié)腸標(biāo)本、急性和慢性結(jié)腸炎模型小鼠的結(jié)腸組織稱(chēng)重，按照EASY spin組織/細(xì)胞RNA快速提取試劑盒操作說(shuō)明書(shū)提取總RNA，根據(jù)OD260/OD280比值估測(cè)RNA質(zhì)量，比值在1.8～2.0滿(mǎn)足實(shí)驗(yàn)要求。取2 μg總RNA為模板逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，高壓滅菌蒸餾水稀釋2倍，以GAPDH為內(nèi)參，Real-time qPCR法檢測(cè)KDM5C、TNF-α、干擾素-γ(IFN-γ)、IL-6和IL-1βmRNA的相對(duì)表達(dá)量。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件：65 ℃ 5 min，37 ℃ 15 min，98 ℃ 5 min。real-time qPCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性10 min，95 ℃變性10 min，56 ℃～64 ℃退火30 s，72 ℃延伸，共40個(gè)循環(huán)。采用2-ΔΔCt法計(jì)算目的基因相對(duì)表達(dá)量。每個(gè)實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次，real-time qPCR引物序列見(jiàn)表2。

表2 引物序列

1.8 生物信息學(xué)數(shù)據(jù)獲取

利用生物信息學(xué)技術(shù)分析KDM5C在IBD患者和正常人腸黏膜中的差異表達(dá)情況，從GEO數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)下載IBD基因芯片數(shù)據(jù)集GSE6731，由Chakravarti等提交，共36個(gè)樣本，包括13例UC患者、19例CD患者的腸黏膜組織及4名正常人的腸黏膜組織(正常對(duì)照者)。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用Graphpad Prism 8.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用單因素方差分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 IBD患者及正常對(duì)照者結(jié)腸組織中的KDM5C mRNA表達(dá)比較

利用Graphpad Prism 8.0軟件對(duì)GSE6731數(shù)據(jù)集進(jìn)行分析，結(jié)果顯示與正常對(duì)照者相比，UC、CD患者結(jié)腸組織中的KDM5CmRNA相對(duì)表達(dá)量均明顯降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)，見(jiàn)圖1A。采用real-time qPCR法檢測(cè)UC、CD患者及結(jié)腸息肉患者(正常對(duì)照)的結(jié)腸組織，發(fā)現(xiàn)與結(jié)腸息肉患者相比，UC和CD患者結(jié)腸組織中的KDM5CmRNA相對(duì)表達(dá)量均明顯降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)，與生物信息學(xué)分析結(jié)果一致，見(jiàn)圖1B。

2.2 慢性結(jié)腸炎模型小鼠結(jié)腸組織中的KDM5C mRNA相對(duì)表達(dá)量比較

采用real-time qPCR法檢測(cè)實(shí)驗(yàn)組1和對(duì)照組1小鼠結(jié)腸組織中的KDM5CmRNA相對(duì)表達(dá)量，結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組1小鼠結(jié)腸組織中的KDM5CmRNA相對(duì)表達(dá)量顯著低于對(duì)照組1，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)圖2。

注：與正常對(duì)照者比較，*P<0.05圖1 UC、CD患者和正常對(duì)照者結(jié)腸組織中的KDM5C mRNA表達(dá)量比較 A GSE6731數(shù)據(jù)集分析 B real-time qPCR法測(cè)得的3組KDM5C mRNA相對(duì)表達(dá)量比較

注：與對(duì)照組1比較，*P<0.05圖2 兩組小鼠結(jié)腸組織中的KDM5C mRNA相對(duì)表達(dá)量比較

2.3 急性結(jié)腸炎模型小鼠疾病表現(xiàn)和炎性反應(yīng)評(píng)估

本研究采用KDM5C-/-小鼠進(jìn)一步研究KDM5C在結(jié)腸炎中的作用，結(jié)果顯示與對(duì)照組2相比，實(shí)驗(yàn)組2的體質(zhì)量在第3天開(kāi)始持續(xù)下降，實(shí)驗(yàn)組3的體質(zhì)量下降更為顯著；第5天時(shí)實(shí)驗(yàn)組3與對(duì)照組2的的體質(zhì)量差異顯著(P<0.05)，第8天時(shí)實(shí)驗(yàn)組2與實(shí)驗(yàn)組3的體質(zhì)量差異顯著(P<0.05)；見(jiàn)圖3A。此外，與對(duì)照組2相比，實(shí)驗(yàn)組2的DAI明顯升高，實(shí)驗(yàn)組3的DAI升高更顯著，且在第8天時(shí)實(shí)驗(yàn)組2與實(shí)驗(yàn)組3的DAI差異顯著(P<0.05)，見(jiàn)圖3B。于構(gòu)建急性結(jié)腸炎模型第8天處死小鼠，分離出完整的結(jié)腸組織，觀(guān)察大體組織學(xué)改變：與對(duì)照組2相比，實(shí)驗(yàn)組2大便稀軟，結(jié)腸長(zhǎng)度明顯縮短且腸腔變細(xì)、僵硬和出血；實(shí)驗(yàn)組3腸腔出血和結(jié)腸縮短較實(shí)驗(yàn)組2更顯著；見(jiàn)圖3C、3D。結(jié)腸組織經(jīng)H-E染色后光鏡下觀(guān)察(×100)示：與對(duì)照組2相比，實(shí)驗(yàn)組2小鼠結(jié)腸腺體結(jié)構(gòu)紊亂、隱窩結(jié)構(gòu)破壞，黏膜和黏膜下層水腫并伴有炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；在實(shí)驗(yàn)組3小鼠腸組織中，這些炎性反應(yīng)表型更為明顯；見(jiàn)圖3E。

注：與對(duì)照組2比較，*P<0.05；與實(shí)驗(yàn)組3比較，#P<0.05；與實(shí)驗(yàn)組2比較，+P<0.05圖3 3組小鼠的疾病表現(xiàn)和炎性反應(yīng)評(píng)估比較 A 體質(zhì)量下降曲線(xiàn) B DAI C 結(jié)腸長(zhǎng)度 D 完整結(jié)腸標(biāo)本 E 遠(yuǎn)端結(jié)腸病理圖 H-E染色 ×100

2.4 KDM5C基因敲除對(duì)炎性因子表達(dá)的影響

為進(jìn)一步研究KDM5C基因敲除加重結(jié)腸炎的潛在機(jī)制，本研究采用real-time qPCR法檢測(cè)了急性結(jié)腸炎模型小鼠結(jié)腸組織中一些炎性因子mRNA相對(duì)表達(dá)量，結(jié)果顯示，與對(duì)照組2相比，實(shí)驗(yàn)組2的KDM5CmRNA相對(duì)表達(dá)量明顯下降，實(shí)驗(yàn)組3的KDM5CmRNA相對(duì)表達(dá)量極低，提示敲除成功；實(shí)驗(yàn)組2結(jié)腸組織中TNF-α、IFN-γ、IL-6和IL-1β的mRNA相對(duì)表達(dá)量均較對(duì)照組2明顯升高(P均<0.05)；實(shí)驗(yàn)組3小鼠結(jié)腸組織中TNF-α、IL-6和IL-1β的mRNA相對(duì)表達(dá)量較實(shí)驗(yàn)組2進(jìn)一步升高(P均<0.05)，而IFN-γ的mRNA相對(duì)表達(dá)量較實(shí)驗(yàn)組2也有所升高，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)圖4。

注：與對(duì)照組2比較，*P<0.05；與實(shí)驗(yàn)組2比較，+P<0.05圖4 3組小鼠結(jié)腸組織中炎性因子mRNA相對(duì)表達(dá)量的比較 A KDM5C B TNF-α C IFN-γ D IL-6 E IL-1β

3 討論

近年來(lái)，越來(lái)越多的研究顯示表觀(guān)遺傳修飾是免疫相關(guān)的炎性疾病的重要發(fā)病機(jī)制之一[12-13]。組蛋白去乙酰化酶抑制劑SAHA可顯著緩解小鼠的慢性結(jié)腸炎和腹膜纖維化[14-15]。在DSS誘導(dǎo)的急性結(jié)腸炎小鼠體內(nèi)注射組蛋白甲基化酶EZH2抑制劑，可增加骨髓來(lái)源的抑制性細(xì)胞(MDSC)富集，對(duì)緩解結(jié)腸炎及預(yù)防結(jié)腸炎相關(guān)結(jié)直腸癌有良好的療效[16]。關(guān)于組蛋白去甲基化酶KDM5C在IBD中的作用尚未見(jiàn)研究報(bào)道。本研究發(fā)現(xiàn)在IBD患者和經(jīng)DSS誘導(dǎo)的慢性結(jié)腸炎模型小鼠結(jié)腸組織中KDM5C轉(zhuǎn)錄水平均明顯降低，提示KDM5C在結(jié)腸炎中可能發(fā)揮抑炎作用。進(jìn)一步構(gòu)建急性結(jié)腸炎模型，結(jié)果發(fā)現(xiàn)KDM5C-/-小鼠對(duì)DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎較WT小鼠更易感，具體表現(xiàn)為小鼠體質(zhì)量下降更快、DAI更高、結(jié)腸出血及縮短更明顯、腸黏膜損傷更重。由此可見(jiàn)，KDM5C基因缺失加重了腸道炎性反應(yīng)，提示KDM5C在IBD發(fā)病過(guò)程中發(fā)揮著抗炎作用。

腸黏膜免疫應(yīng)答紊亂導(dǎo)致的細(xì)胞因子失衡是IBD發(fā)生、發(fā)展的核心環(huán)節(jié)。組蛋白修飾除了直接調(diào)控基因表達(dá)外，還與免疫調(diào)節(jié)、炎性反應(yīng)等多種生物學(xué)功能有關(guān)。JMJD3是組蛋白H3K27的去甲基化酶，不僅參與Th17細(xì)胞的分化，還可促進(jìn)巨噬細(xì)胞向M2型極化[17-18]。在脂多糖(LPS)刺激的巨噬細(xì)胞中，TET2通過(guò)招募組蛋白去乙酰化酶HDAC1/2，下調(diào)IL-6的表達(dá)，從而抑制炎性反應(yīng)持續(xù)發(fā)展[19]。He等[20]發(fā)現(xiàn)泛素連接酶FBXW7可通過(guò)靶向降解EZH2增加CCL2、CCL7等趨化因子在結(jié)腸固有層聚集，從而加重腸道炎性反應(yīng)。上述研究均證明組蛋白修飾可通過(guò)調(diào)節(jié)炎性因子參與IBD的發(fā)生、發(fā)展。近年來(lái)研究顯示長(zhǎng)鏈非編碼RNA LOXL1-AS1通過(guò)KDM5C上調(diào)IL-6、IL-8的表達(dá)，從而加重骨關(guān)節(jié)炎[21]。TNF-α、IFN-γ、IL-6和IL-1β等炎性因子的過(guò)量產(chǎn)生與腸黏膜屏障損傷及腸道慢性炎性反應(yīng)密切相關(guān)，抗TNF-α單抗已成為治療IBD的重要手段并取得良好療效，被納入了國(guó)內(nèi)外IBD治療指南[22-23]。本研究采用real-time qPCR法檢測(cè)了小鼠結(jié)腸組織中一些炎性因子mRNA的相對(duì)表達(dá)量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)KDM5C基因缺失可誘導(dǎo)結(jié)腸組織中TNF-α、IFN-γ、IL-6、IL-1β的mRNA相對(duì)表達(dá)量明顯升高，與上述結(jié)論一致，提示KDM5C可通過(guò)抑制炎性因子表達(dá)而發(fā)揮抗炎作用。

綜上所述，KDM5C基因敲除可加重DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎，這種效應(yīng)可能是通過(guò)上調(diào)促炎因子的表達(dá)而實(shí)現(xiàn)的。本研究為進(jìn)一步探討KDM5C在結(jié)腸炎發(fā)病機(jī)制中的作用提供了依據(jù)和線(xiàn)索。然而，本研究尚存在不足：(1)KDM5C基因敲除后上調(diào)TNF-α、IL-6、IL-1βmRNA的表達(dá)是否通過(guò)調(diào)節(jié)H3K4三甲基化發(fā)揮作用，有待進(jìn)一步研究；(2)本研究中KDM5C基因敲除小鼠數(shù)量較少，因全身性KDM5C基因敲除小鼠存在發(fā)育遲緩和雌性純合子致死的問(wèn)題，今后本課題組將培育更多的雄性純合子KDM5C-/-小鼠，通過(guò)模式動(dòng)物深入研究其在腸道炎性反應(yīng)中的作用及具體機(jī)制。