正交試驗法優選尿石清合劑的水提醇沉工藝

楊素紅，胡玉良

(廣州中醫藥大學附屬中山中醫院制劑室，中山 528400)

尿石清合劑是本院自制制劑，主治濕熱下注型石淋、熱淋等，用于治療膀胱結石、腎結石、輸尿管結石及泌尿系統感染。其處方主要組成為廣金錢草、梔子、滑石等[1]。該方系根據本院治療泌尿系統結石的有關資料，經臨床實踐應用幾十年而成。由于原工藝為水提，水提液中含有多種無效成份和雜質，影響了口感和療效。為了減少制劑的體積，提高有效成份的含量，進而將此方改為口服液。因此，需要對工藝進行改良，常用的中藥凈化方法為水提醇沉。梔子是方中的君藥，梔子苷是梔子中活性成份，尿石清合劑質量標準中含量測定項便以梔子苷為量化指標。總固物是常用的水提工藝研究考察指標，故選取總固物重量和梔子苷含量為考察指標，采用正交試驗設計方法對水提工藝進行優選。另外，醇沉是常用的中藥純化工藝，采用正交試驗設計方法對醇沉工藝進行優選，以篩選最佳制備工藝，為后續該制劑的進一步研發提供參考。

1 材料

1.1 藥品與試劑

梔子苷對照品(中國食品藥品檢定研究院，批號110749-201316，含量以97.5%計)；所用藥材均購于廣東致信藥業有限公司，經鑒定符合《中國藥典》2020年版規定[2]；流動相采用甲醇為色譜純；水為超純水；其他試劑為分析純。

1.2 儀器

Agilent 1260高效液相色譜儀[安捷倫科技(中國)有限公司]；Inertsil?ODS-3色譜柱(日本島津公司)；BS224S電子天平[賽多利斯(北京)有限公司]。

2 方法與結果

2.1 總固物重量的測定

按處方比例稱取適量的藥材，加水提取，精密量取提取液25 ml，置于經105 ℃干燥至恒重的蒸發皿中，水浴蒸干，置于105 ℃干燥3 h，取出，移置干燥器中放置30 min，迅速精密稱定重量，計算總固物重量。

2.2 梔子苷含量的測定[3-5]

2.2.1色譜條件

色譜柱：C18色譜柱；流動相：甲醇-水(20∶80)；柱溫：30 ℃；檢測波長：236 nm。

2.2.2溶液制備

2.2.2.1 供試品溶液

精密量取供試品5 ml于50 ml量瓶中，加50%甲醇至刻度，搖勻；再精密量取5 ml于25 ml量瓶中，加50%甲醇至刻度，搖勻、過濾即得。

2.2.2.2 對照品溶液

精密稱取5 mg的梔子苷對照品于25 ml量瓶中，加50%甲醇至刻度；再精密量取2 ml于20 ml量瓶中，加50%甲醇至刻度，搖勻，即得。

2.2.3含量測定

在上述色譜條件下，精密吸取對照品溶液和供試品溶液各20 μl,分別注入液相色譜儀中，測定梔子苷含量。

2.3 水提工藝研究[2,6-7]

2.3.1正交試驗設計

水提工藝選取加水量(A)、浸泡時間(B)、提取時間(C)、提取次數(D)為考察因素，每個因素設3個水平，按L9(34)正交設計表進行試驗，以總固物重量和梔子苷含量為評價指標，因素水平選擇見表1。

表1 水提工藝正交試驗設計因素和水平

2.3.2試驗方法與結果

稱取1/10處方量藥材，共9份，按表1正交試驗表試驗，結果見表2。

表2 水提工藝優選正交試驗結果

2.3.3結果分析

由表2可知，總固物重量的影響試驗因素依次為A>D>B>C，確定梔子的最佳提取條件為A3B1C2D2，即加12倍量水浸泡0.5 h，提取2次，每次1.5 h。梔子苷含量的影響因素依次為B>A>C>D，確定梔子的最佳提取條件為A3B2C3D1，即加12倍量水浸泡1 h，提取1次，提取2 h。綜合考慮，最好的方案為A3B2C3D2，即加12倍量的水，浸泡 1 h，提取2次，每次2 h。

2.3.4驗證試驗

根據所選的最佳提取條件，進行3次驗證試驗。分別按照處方比例，稱取藥材，以較優的工藝A3B2C3D2提取，分別測定總固物重量和梔子苷含量，記錄結果，見表3。

表3 水提工藝驗證試驗結果

總固物重量和梔子苷含量的RSD分別為0.43%和1.84%，說明該工藝科學合理，質量穩定。

2.4 醇沉工藝優選[8]

2.4.1正交試驗設計

選擇藥液相對密度(A)、含醇量(B)、醇沉時間(C)為考察因素，每個因素設3個水平；按L9(34)正交試驗表,設9次試驗；取適量水提液水浴濃縮至相對密度分別為1.05、1.10和1.15，取50 ml濃縮液，于60 ℃時緩緩加入適當比例的乙醇，使其含醇量達到60%、70%和80%，攪拌均勻后分別置室溫放置12、24和48 h，濾過，濾液置蒸發皿中，80 ℃水浴濃縮揮發乙醇至無醇味，按照“2.2.2.1”制備供試品溶液，測定梔子苷含量。因素水平見表4。

表4 醇沉工藝優選正交試驗因素和水平

2.4.2試驗方法與結果

按照優選的水提工藝制備藥液，取9份，每份100 ml，按表4正交試驗表進行試驗，結果見表5。

表5 醇沉工藝正交試驗結果

2.4.3結果分析

由直觀分析可知，影響醇沉效果的因素順序為A>C>B，由此得出的最佳工藝組合為A2B1C2，即醇沉濃度60%，藥液初始相對密度1.10，醇沉時間24 h。

2.4.4驗證試驗

根據所選的最佳醇沉條件，進行3次驗證試驗，分別測定梔子苷含量，結果見表6。

表6 醇沉工藝驗證試驗結果

梔子苷含量保持在一個較穩定的范圍內，RSD為1.16%，說明該工藝科學合理，質量穩定。

3 討論

尿石清合劑方中含有黃酮類、環烯醚萜苷、有機酸、皂苷類、三萜類、甾體類、多糖類等多種類型化學成份。其中梔子的化學成份達100多種，有環烯醚萜類、黃酮類、有機酸酯類、多糖類、醛類、醇類、長鏈烷烴類等。雖然梔子的化學成份較為復雜，但目前對梔子的利用主要是從梔子中提取梔子黃色素和梔子苷[9]，臨床上用于肝炎、尿路感染等。干浸膏是復方制劑中發揮臨床作用的物質基礎，浸膏得率的高低可在很大程度上反映出制劑工藝的優劣。因此，最終選擇水提液的總固體物和梔子苷含量作為水提工藝正交試驗的評價指標。

水提醇沉是常用的中藥提取工藝[10]，可去除藥液中淀粉、蛋白質等大分子，保留生物堿類、苷類、有機酸類、氨基酸、多糖等有效成份，提高澄明度、降低出膏率、減少患者每日服用量。本研究采用優化的水提工藝可獲得干浸膏得率和梔子苷含量均較高的提取物，結合醇沉工藝除雜質，大大提高了制劑質量。優化的水提醇沉工藝可用于尿石清合劑組方藥材的提取、純化，使制劑具有更高的品質，為劑型改良和工業化大生產提供參考。

由于時間和條件所限，課題組暫未對工藝優化后的制劑療效進行系統研究，日后可繼續進行有關藥效學研究和臨床療效觀察，比較醇沉前后提取物的藥效變化，以進一步闡明工藝優化的價值。