消化道營養物質吸收代謝晝夜節律性調控機制的研究進展

習瓚娜,裴江蘭,甄永康,王夢芝

（揚州大學動物科學與技術學院,中國江蘇 揚州 225009）

晝夜節律存在于生物體內多種生理生化過程中,調節機體環境與生理過程之間的相互作用,使生物體能更好地適應外界環境的節律改變[1]。研究表明,晝夜節律能夠調控生物體對營養物質的吸收代謝,并影響各種營養物質的功能[2～3]。例如:大鼠的體內實驗顯示,葡萄糖攝取具有明顯的24 h節律[4];小鼠腸道中肽轉運蛋白1（peptide transporter 1,PEPT1）的表達具有節律性[5];芳香烴受體核轉位蛋白樣1（brain and muscle ARNT-like 1,Bmal1）基因被證明可以調節腸道脂質吸收的節律[6]。晝夜節律調節多種胃腸功能,包括細胞增殖、免疫穩態、腸道通透性及微生物的平衡和代謝[7～12]。晝夜節律的破壞會造成多種生理功能的失調,對生物體的健康產生極其嚴重的影響。比如:Bmal1突變的小鼠和Clock（circadian locomotor output cycles kaput）突變的小鼠的胃腸都表現出細胞增殖的紊亂[8～9];Per1（Period1）和 Per2（Period2）基因敲除小鼠的腸道微生物的節律消失,晝夜節律被打亂,導致腸道菌群失調[10～12]。此外,晝夜節律紊亂會增加消化系統疾病的易感性,如腸道炎癥、十二指腸潰瘍、腸應激疾病和胃腸癌癥[13～14]。相關研究報道,結腸癌組織中存在Clock基因的突變[15];在小鼠中,晝夜節律紊亂損害腸道屏障的完整性[16];敲除Clock或Cry（cryptochrome）基因的小鼠比野生小鼠產生更多的促炎細胞因子[17];與白班工人相比,夜班工人感染胃炎和消化性潰瘍的風險較高[18]。因此,晝夜節律在胃腸中發揮重要作用,進一步研究生物鐘與消化道營養物質吸收代謝之間的關系,對調控機體健康有一定的參考意義。

1 消化道晝夜節律系統及其對消化循環的影響

沿胃腸道布的營養傳感器可釋放大量影響胃腸功能、營養穩態和能量平衡的信號肽[19]。Furuya和Yugari首先在1974年證明了腸道吸收在大鼠中表現出晝夜節律[20～21]。與早餐后的消化率相比,晚餐后的消化率和腸吸收率要低[22]。研究表明,消化道存在生物鐘基因,這些生物鐘基因參與胃腸功能和活動,如胃排空、結腸蠕動、胃液分泌和酶的活動[7,23]。Bmal1通過調節應激反應,促進腸上皮24 h節律的產生[8]。敲除Per1或Per2會改變結腸的運動節律,同時敲除Per1和Per2可使小鼠結腸活動的晝夜節律消失[24]。有研究發現,嚙齒動物的生物鐘基因在胰腺中也以晝夜節律的方式表達。針對缺乏生物鐘基因Bmal1的小鼠胰腺進行的研究發現,實驗小鼠存在嚴重的葡萄糖不耐受和胰島素分泌缺陷[25～26]。目前,胰酶淀粉酶和胰蛋白酶分泌的晝夜節律變化在人類受試者中已被報道[27]。此外,胰島素分泌率也被證明有晝夜節律性,其中血漿胰島素水平在清晨增加,下午達到峰值,晚上下降[28]。由此可見,消化道的生物鐘基因以晝夜節律的方式表達,它們可能是胃腸活動的重要調控因子。

2 晝夜節律與消化道營養物質吸收代謝

晝夜節律系統在營養吸收方面起著重要作用,正常的生物鐘系統有利于營養物質的吸收利用。腸道生物鐘的破壞會影響營養物質的吸收與節律性,Pan等[29]研究發現,在小鼠小腸中,轉運營養物質水解產物的轉運蛋白的mRNA表達具有晝夜節律,而這些營養轉運蛋白的晝夜節律在Clock突變小鼠中消失,并且Clock突變小鼠吸收營養物質的量也發生了改變,這說明生物鐘調控著腸道內多種營養物質的轉運。

2.1 葡萄糖吸收代謝的節律性和調節機制

碳水化合物主要由單糖（葡萄糖、果糖和半乳糖）、二糖（乳糖和蔗糖）和多糖（淀粉和纖維素）組成。多糖通過小腸刷狀緣水解酶的作用分解為單糖,腸腔中的單糖被腸上皮細胞吸收,這些單糖通過腸上皮細胞基底外側的轉運蛋白從漿膜側輸出到腸上皮細胞外,進入血液循環[30]。鈉葡萄糖協同轉運蛋白1（sodium/glucose cotransporter 1,SGLT1）、葡萄糖轉運蛋白2（glucose transporter 2,GLUT2）和GLUT5是存在于嚙齒動物小腸中的主要己糖轉運蛋白,它們協同促進腸道中葡萄糖的吸收[31]。

大鼠體內實驗顯示,無論是在實驗前1 h禁食還是按照預定的喂養方案喂食,葡萄糖攝取都表現出明顯的24 h節律[4],這表明在正常喂養條件下,葡萄糖攝取的晝夜節律與進食模式無關,可能由視交叉上核（suprachiasmatic nucleus,SCN）中的晝夜節律系統調節。有研究發現,Sglt1的mRNA表達具有明顯的晝夜節律[32～33]。此外,Glut2和Glut5的表達也具有節律性[34～35]。染色質免疫沉淀（chromatin immunoprecipitation,ChIP）實驗發現,Bmal1與己糖轉運蛋白編碼基因的啟動子結合[35]。以上信息提示,Bmal1可能直接調節基因Sglt1、Glut2和Glut5的表達,己糖轉運蛋白的調控直接受時鐘基因的控制。

O′brien等[19]在研究鼠胃腸道糖傳感器相關基因和蛋白質的表達水平時發現,甜味受體（Tas1r2,Tas1r3,Gnat3,Gnat1）、糖轉運蛋白（Sglt1,Glut2,Glut5）和特定糖傳感器（Slc5a4a,Slc5a4b）基因的表達水平分別在舌頭、近端與遠端小腸中最高,生物鐘基因（Cry2/Bmal1）在所有研究區域均可檢測到活動,盡管SGLT3蛋白的表達未檢測到節律性,但是Slc5a4a和Slc5a4b基因的表達分別在小腸和胃中顯示出明顯的晝夜節律性,同時,Tas1r2、Tas1r3和Gnat1在近端小腸中也表現出明顯的表達節律。這說明,胃腸道糖傳感器基因可能受生物鐘基因調控,生物鐘基因與營養素相互作用。

2.2 脂質吸收代謝的節律性和調節機制

生物鐘在調節腸細胞的脂質吸收中也起重要作用,越來越多的研究表明,晝夜節律紊亂會增加脂質積累的風險,導致脂質吸收受損[36～37]。脂肪從腸腔攝取到腸細胞的主要步驟是膽汁乳化、脂肪酶水解和轉運體攝取[38～44]。脂肪酸通過脂肪酸結合蛋白在細胞內轉運,在內質網中,脂肪酸用于合成三酰基甘油、磷脂和膽固醇酯,這些脂質被包裝成稱為乳糜微粒的脂蛋白[45～46]。乳糜微粒是非常大的富含三酰基甘油的球形顆粒,含有磷脂和膽固醇,這些顆粒的表面覆蓋有磷脂單層、游離膽固醇和幾種載脂蛋白。乳糜微粒組裝需要兩種蛋白質:載脂蛋白B（apolipoprotein B,ApoB）和微粒體甘油三酯轉移蛋白（microsomal triglyceride transfer protein,MTP）。

有研究表明,脂質的吸收在24 h內差異顯著,Clock的過表達會顯著降低Mtp的表達[29,47]。CLOCK:BMAL1異二聚體有節奏地激活小異二聚體伴侶（small heterodimer partner,SHP）,從而抑制Mtp的表達[47]。相關研究報道,小鼠在夜間吸收的甘油三酯和膽固醇含量明顯高于白天,并且甘油三酯和膽固醇的吸收與ApoB和MTP的表達表現出相關的晝夜波動[48];小鼠小腸中有晝夜節律因子Noc（nocturnin）的表達,與Noc+/+小鼠相比,Noc-/-小鼠吸收更少的甘油三酯和膽固醇[49～50];Noc的轉錄起始位點上游具有E-box,而CLOCK:BMAL1異二聚體可與這些序列直接結合[51]。這些研究表明Clock參與脂質轉運的日常調控。

此外,Pan等[29]在正常晝夜循環和自由獲取食物的條件下,還研究了其他參與脂質合成和吸收的基因的表達,發現二脂酰基甘油酰基轉移酶2（diacylglycerol acyltransferase 2,Dgat2）、脂肪酸結合蛋白（fatty acid-binding protein,Fabp）、硬脂酰輔酶A去飽和酶1（stearyl coenzyme A dehydrogenase 1,Scd1）和肪酸合成酶（fatty acid synthase,Fas）的mRNA呈現日變化。本實驗室前期研究發現,生物鐘基因參與瘤胃上皮揮發性脂肪酸（volatile fatty acid,VFA）代謝的調控,Clock、Bmal1、Per2 和Per3與單羧酸轉運蛋白1/4（monocarboxylate transporter 1/4,Mct1/4）存在顯著的相關性[52]。綜上可知,晝夜節律參與調節脂質合成和吸收。

2.3 蛋白質吸收代謝的節律性和調節機制

生物鐘基因已被證明可以調節腸道肽轉運蛋白的節律[53]。蛋白質在消化道中被消化成氨基酸、二肽和三肽,其中,二肽和三肽由PEPT1轉運。PEPT1是質子依賴的肽共轉運蛋白,能夠將H+和肽轉運到腸上皮細胞中,肽的轉運與H+濃度相關,而與細胞內肽的濃度無關。為了能夠有效進行肽的轉運,細胞內的H+濃度被Na+/H+轉運蛋白3（Na+/H+exchanger 3,NHE3）維持在較低水平。該轉運蛋白將H+泵入腸細胞,并交換出Na+,使細胞內Na+濃度保持較低水平,同時K+-ATP酶泵出Na+,輸入K+。機體通過這些轉運蛋白的共同作用促進腸上皮細胞對肽的攝取。所有的肽在腸上皮細胞的細胞質中被水解為氨基酸,并通過氨基酸轉運蛋白跨過基底外側轉移到血液循環中[54～55]。

大鼠結腸中Nhe3的表達具有晝夜節律性[54]。研究報道,Cry1和Cry2敲除小鼠與Clock突變小鼠中Nhe3的mRNA表達均降低[54];Nhe3的啟動子含有一個E-box序列,該序列可被CLOCK:BMAL1異二聚體反式激活,提示Nhe3的這種有節奏的表達可能是由結腸生物鐘驅動的[5,54]。

PEPT1的表達在24 h內也會發生節律性變化。Pan等[5]檢測了自由進食糖基肌氨酸并保持12 h︰12 h光暗周期的大鼠小腸中PEPT1的每日節律,發現PEPT1的蛋白質水平和mRNA水平在20:00時最高,在08:00時最低。但是,Saito等[55]發現,決定Pept1表達的轉錄因子SP1和CDX2在24 h內沒有表達變化;此外,調節Pept1的另一種轉錄因子過氧化物酶體增殖物激活受體α（peroxisome proliferator-activated receptor α,PPARα）的缺乏雖然會降低Pept1的基礎表達水平,但對其每日表達沒有顯著影響[56],這表明它們可能不參與Pept1的晝夜節律調節。Okamura等[56]發現,Dbp（D site of albumin promoter binding protein）的mRNA水平的日常節律與Pept1的mRNA的節律相似。此外,該研究團隊確定了Pept1遠端啟動子區域中的DBP結合位點,并得出結論:DBP可能有助于Pept1表達的節律性變化。另外有研究發現,小鼠胃蛋白酶原的分泌在24 h內呈周期性變化,在休息期間達到高峰[57]。同樣,胰液的分泌在大鼠和豬中都有晝夜節律性[58～59]。

2.4 離子吸收代謝的節律性和調節機制

結腸介導的電解質穩態受晝夜節律調節[60]。結腸的主要功能是吸收水和電解質,Na+和Cl-的吸收主要反映了兩種轉運體的活性,一種是Na+/H+交換器（NHE）,另一種是Cl-/HCO3-交換劑（anion exchanger protein,AE）。研究表明,Nhe3和Ae1的表達具有晝夜節律,此外,參與NaCl吸收的其他關鍵轉運蛋白和通道蛋白也受生物鐘基因的調控,如大鼠結腸黏膜鈉鉀ATP酶蛋白A1（Atp1a1）、

上皮鈉離子通道蛋白γ（epithelial sodium channel gamma,γEnac）、下調式腺瘤載體（downregulated in adenoma,Dra）的mRNA表達均表現出晝夜節律變化[61]。研究報道,血漿醛固酮和γEnac轉錄本之間的峰值水平具有相關性[61],這表明醛固酮可能在γEnac的調節中發揮作用。此外,參與NaCl吸收的轉運蛋白的表達可能直接受晝夜節律的控制,有研究發現,CLOCK:BMAL1異二聚體調控Nhe3啟動子區域內的E-box[54];小鼠中Cry1和Cry2的雙重敲除或Clock的突變均會使Nhe3的mRNA表達降低[54]。總而言之,生物鐘參與腸道NaCl吸收,對腸道運輸具有重要作用。

3 小結與展望

營養素的吸收代謝與晝夜節律聯系密切,晝夜節律可調控消化道多種營養素的吸收及其相關轉運蛋白的表達（圖1）。從目前研究結果來看,生物鐘與消化道營養代謝的互作調控機制沒有形成網絡聯系,主要體現在以下幾個方面:1）影響機體生物鐘節律的營養水平、營養代謝產物及參與營養吸收代謝的酶還需進行探索;2）節律基因調控營養物質吸收代謝相關因子的位點鑒定尚不能確定;3）生物鐘基因在轉錄、翻譯等不同水平上對消化道的調控機制還不清楚;4）不同動物上的研究尚不系統。因此,未來應從以上幾個方向著手進行深入研究,以了解更多營養物質吸收代謝過程中晝夜節律調節的分子機制。

圖1 調節營養物質代謝的生物鐘機制CLOCK:BMAL1異二聚體與啟動子中的E-box元件結合激活Per和Cry基因的轉錄。PER蛋白和CRY蛋白形成復合物并抑制CLOCK:BMAL1異二聚體的活性,從而抑制其自身表達。CLOCK:BMAL1異二聚體也激活核受體REV-ERBα（reverse erythroblastosis virus α）和視黃素受體相關的孤兒受體 α （retinoid-related orphan nuclear receptor α,RORα）的轉錄,這些轉錄因子競爭性地結合Bmal1和核因子白細胞介素3（nuclear factor interleukin 3,Nfil3）啟動子中的RORE反應元件（RORE激活BMAL1和NFIL3的表達,而REV-ERBα抑制BMAL1和NFIL3的表達）。NFIL3和DBP共同調節D-box啟動元件（NFIL3負向調節,DBP正向調節）,這兩種因子協同D-box調控Per2基因的表達,也調節時鐘控制基因（clock-controlled genes,CCGs）,使CCGs的表達具有晝夜節律。此外,CLOCK:BMAL1異二聚體還調節參與營養物質代謝的CCGs的晝夜節律表達。例如:BMAL1與己糖轉運蛋白編碼基因Sglt1、Glut2和Glut5的啟動子結合,參與糖代謝;CLOCK:BMAL1異二聚體有節奏地激活SHP,從而使SHP抑制Mtp的表達,參與脂代謝;CLOCK:BMAL1異二聚體與Noc轉錄起始位點上游的E-box結合,參與脂代謝;CLOCK:BMAL1異二聚體反式激活Nhe3啟動子中的E-box序列,調節機體蛋白質代謝。Fig.1 The biological clock in nutrient metabolism regulationCLOCK:BMAL1 heterodimer combines with the E-box element in the promoter to activate the transcription of Per and Cry genes.PER and CRY proteins form complexes and inhibit the activity of the CLOCK:BMAL1 heterodimer,thus inhibiting its own expression.CLOCK:BMAL1 heterodimer also activate transcription of the reverse erythroblastosis virus α （REV-ERBα）and retinoid-related orphan nuclear receptor α （RORα）,which competitively bind the RORE response elements in the promoters of Bmal1 and nuclear factor interleukin 3（Nfil3）.RORE activates the expression of BMAL1 and NFIL3,while REV-ERBα inhibits their expression.NFIL3 and DBP adjust the D-box element（NFIL3 negative adjustment,DBP positive adjustment）.These two factors cooperate with D-box to regulate the expression of Per2 gene,and also regulate clock-controlled genes（CCGs）,so that CCGs have the circadian rhythm of expression.Furthermore,CLOCK:BMAL1 heterodimer also regulates the expression of circadian rhythm of CCGs involved in nutrient metabolism.Here are some examples:BMAL1 binds to the promoters of Sglt1,Glut2,and Glut5,participating in glucose metabolism;CLOCK:BMAL1 heterodimer activates SHP rhythmically,making SHP inhibit Mtp expression and participating in lipid metabolism;the heterodimer binds to the upstream E-box of Noc transcription start site,participating in lipid metabolism;the heterodimer transactivates the E-box sequence in the Nhe3 promoter,regulating protein metabolism.